معلومة

لماذا يوجد نوعان من البروتينات المتماثلة المترجمة من الحمض النووي الريبي لفيروس فسيفساء التبغ؟

لماذا يوجد نوعان من البروتينات المتماثلة المترجمة من الحمض النووي الريبي لفيروس فسيفساء التبغ؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أحاول أن أفهم كيف يتم التعبير عن TMV وقرأت (هنا) أن هناك شكلًا كبيرًا وصغيرًا من RNA المعتمد على RNA. تُترجم هذه من نفس منطقة الجينوم ، وهي المنطقة الأكبر التي تنشأ من قراءة كودون توقف متسرب.

لماذا يوجد نوعان من النسخ المتماثلة؟ كان انطباعي الأول أن كلًا منها قد ينتج رنا فرعيًا جينوميًا ، واحدًا لبروتين الحركة والآخر لبروتين القفيصة ، لكن لم أجد أي تقارير تؤكد ذلك.


اجابة قصيرة

اعتبارًا من عام 2021 ، كان الأساس المنطقي لإنتاج بروتينين من الجين المتماثل لـ Tobacco Mosaic Virus (TMV) هو غير مفهومة بشكل كامل. يشترك البروتينان في بعض الأنشطة دون غيرها ، وعلى الرغم من أنهما يبدو أنهما يتعاونان في عملية النسخ المتماثل ، إلا أن هناك زيادة بمقدار عشرة أضعاف عن البروتين الأصغر بالنسبة إلى الأكبر.

يعد إجابة

"لماذا يوجد شكل 126 كيلو دالتون و 183 كيلو دالتون من النسخ المتماثلة للحمض النووي الريبي المعتمد على TMV RNA؟" تستند إجابتي بشكل أساسي إلى المراجعة التي أجراها باك (Phil. Trans. R. Soc. Lond. B (1999) 354، 613-627) ، ولكنها تتضمن مواد من بعض المصادر اللاحقة (مثل Malpica-López وآخرون. (2018)). تميل العديد من الأوراق البحثية الحديثة نسبيًا المتعلقة بالنسخة المتماثلة (على سبيل المثال هذا من عام 2008 وهذا من عام 2012 إلى تجنب هذا السؤال ، وتقتصر على وصف خصائص البروتينين. النقاط الرئيسية هي:

  • كل من البروتينات 126-kDa و 183-kDa المشفرة بواسطة TMV مطلوبة لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة في النسخ المتماثل لـ TMV RNA. البروتين كامل الطول مطلوب تمامًا ؛ يؤدي منع إنتاج البروتين الأصغر إلى تقليل معدل التضاعف إلى 20٪ من المعدل الطبيعي.
  • يبلغ معدل قراءة كود الإيقاف حوالي 10٪ ، لذا فإن نسبة 126-كيلو دالتون: بروتينات 183-كيلو دالتون هي 10: 1.
  • يحتوي جزء القراءة من بروتين 183 كيلو دالتون على أشكال من الأحماض الأمينية المميزة لبوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي (RdRps) ومن ثم من المرجح أن يوفر البروتين 183 كيلو دالتون النشاط التحفيزي لتخليق الحمض النووي الريبي TMV من ركائز NTP.
  • "المجال الطرفي C لبروتين TMV 126-kDa يشبه الهيليكس. على الرغم من أن نشاط الهليكس لم يتم إثباته بعد لبروتين 126 كيلو دالتون لأي فيروس توبام ، فإن هذه البروتينات تحتوي على ستة أشكال من الأحماض الأمينية ، والتي يتم حفظها بشكل كبير في الهليكازات المعروفة ، مثل عامل البدء الانتقالي eIF-4A. "
  • يحتوي بروتين TMV 126-kDa على مجالين. من المحتمل أن يكون مجال N- طرفي مع أشكال الأحماض الأمينية والبنية الثانوية المتوقعة النموذجية لبروتينات ربط S-adenosylmethionine و methyltransferases و guanylyltransferases لتركيب هيكل غطاء 5 'm7GpppG. ثبت أن بروتين TMV 126-kDa له نشاط guanylyltransferase ".
  • يحتوي بروتين 126 كيلو دالتون على نشاط في إسكات قمع المضيف المضاد للفيروسات. يفتقر بروتين 183 كيلو دالتون إلى هذا النشاط ، مما يشير إلى وجود اختلاف في التشكل فيما يتعلق بالمنطقة المسؤولة.
  • هناك دليل على ارتباط شكلين من النسخ المتماثلة في تكاثر الحمض النووي الريبي الفيروسي المرتبط بالغشاء. ومع ذلك ، لا توجد معلومات هيكلية مباشرة (مثل علم البلورات بالأشعة السينية ، cryo-EM) متاحة لمجمع مع أو بدون RNA.

الاقتراح الوحيد الذي يقدمه باك هو أنه نظرًا لأن نشاط الهليكاز مطلوب لغرضين منفصلين - لفك الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة أثناء النسخ المتماثل ، ولإزالة البنية الثانوية من الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة عند استخدامه كقالب لنسخ متعددة من التكميلية حبلا - قد يكون لشكلَي النسخة المتماثلة خصوصية ركيزة مختلفة في نشاط هليكاز الخاص بهما.

الأفكار الخاصة

من الشائع أن القيود المفروضة على بدء ترجمة الرنا المرسال حقيقية النواة والحجم الصغير للجينومات الفيروسية قد أدت إلى اعتماد فيروسات استراتيجيات مختلفة لتعظيم إمكانات الترميز الخاصة بهم. القراءة من خلال ليست فريدة من نوعها لهذه الفئة من الفيروسات. أتخيل أن النسخة المتماثلة سبقت القراءة ، وفي هذه الحالة يتساءل المرء عما إذا كان الإنزيم الأصلي عبارة عن ثنائي ثنائي مغاير ، والذي تم استبداله بواسطة ثنائي مغاير مع تفاعل بروتين-بروتين مماثل. تكمن المشكلة هنا في أن الإنزيم المعاصر له موقع نشط واحد فقط. من الواضح أن المعلومات الهيكلية مطلوبة لمعالجة هذه الاحتمالات.

حاشية سفلية: التسمية

يشير السؤال الأصلي وبعض المصادر (بشكل رئيسي في البيولوجيا الهيكلية) إلى أشكال 126-kDa و 183-kDa على أنها الوحدات الفرعية من النسخة المتماثلة. لا تستخدم معظم المصادر الفيروسية هذا الوصف ، والذي أعتقد أنه مضلل لأنه يتجاهل 90٪ من بروتين 126 كيلو دالتون الذي لا يمكن أن يشارك في التكرار ، وبالتالي لا يعمل كوحدة فرعية متماثلة. كما يقترح مستوى من التحليل البنيوي غير موجود. على الرغم من أن الإنزيمات المتماثلة غالبًا ما تحتوي على العديد من الوحدات الفرعية ، إلا أنها تتميز بشكل عام من الناحية الهيكلية. الوضع مع TMV مختلف.


يوجد بوليميريز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي لفيروسات Tobam ​​كمغير متغاير معبر عنه بقراءة جزء RdRP من الجينوم (إطارات قراءة مفتوحة 1 و 2). إن منتجات ORFs هذه عبارة عن بروتينين من 183 كيلو دالتون (وحدة فرعية كبيرة متماثلة) و 126 كيلو دالتون (وحدة فرعية صغيرة مكررة) ، مع إنتاج 126 كيلو دالتون تقريبًا 10x أكثر من شكل 183 كيلو دالتون. تم وصف وظائف وأحجام البروتينات المختلفة جيدًا في واتانابي وآخرون., (1999):

يتكون جينوم فيروس موزاييك التبغ (TMV) من جزيء RNA أحادي الشريطة يبلغ طوله حوالي 6400 نيوكليوتيد مع قطبية موجبة ، والذي يشفر على الأقل أربعة عديد ببتيدات: 126- و 183 كيلو دالتون بروتينات مطلوبة للنسخ والتكرار (المشار إليها فيما يلي) كبروتين 126 كيلو و 183 كيلو على التوالي) ، بروتين 30 كيلو دالتون (30 كيلو دالتون) لحركة الفيروس من خلية إلى خلية في النباتات المصابة ، وبروتين 18 كيلو دالتون لتكوين غلاف الفيروس. يتم ترميز تسلسل البروتين 126K بواسطة المنطقة القريبة 5'من الجينوم الفيروسي ويتضمن أشكال ميثيل ترانسفيراز و RNA هيليكس ، بينما بروتين 183K عبارة عن بروتين قراءة لإطار القراءة المفتوح 126K (ORF) ويحتوي على ، بالإضافة إلى الشكلين المذكورين أعلاه ، عزر RNA polymerase المعتمد على RNA. يعتبر بوليميريز الحمض النووي الريبي متورطًا في كل من النسخ والنسخ المتماثل (8). من تحليل التسلسل ، يُعتقد أن بوليميريز RNA الفيروسي يحتوي على بروتين 183K كوحدة فرعية تحفيزية ، ولكن لم يتم تحديد التركيبات الجزيئية الدقيقة للنسخة والنسخة المتماثلة.

السمة الشائعة لـ RdRPs في فيروسات RNA هي أنها موجودة كمتغايرات مغايرة. أحد الأمثلة المعروفة جدًا على ذلك هو RdRP لفيروس الأنفلونزا (-ssRNA) ، والذي يوجد كمقاوم غير متجانس يتكون من الوحدات الفرعية PB1 و PB2 و PA المنتجة من شظايا الجينوم التي تحمل نفس الاسم. ومع ذلك ، توجد (العديد) الأمثلة الأخرى في عالم الفيروسات ، بما في ذلك جنس فيروس نباتي آخر بوتيفيروس، الذي يشترك مع فيروسات Tobamovirus و 90٪ من فيروسات النبات ، هو فيروس RNA أحادي الشريطة إيجابي المعنى. لقد تم للتو نشر ميزات Potyvirus RdRP ، وللاقتباس من المقالة المرتبطة (والمراجع الواردة فيها):

يبدو أن التفاعل الذاتي لـ RdRp-RdRp هو سمة مشتركة لفيروسات الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي وحيدة الشريطة ، بما في ذلك الفيروسات التي تصيب الحشرات والحيوانات والبشر والنباتات [38،49،50،51،52، 53]. قد يؤدي تضاعف أو قلة القلة في RdRps إلى زيادة استقرار هذه الإنزيمات والحماية من التدهور.

كما ترون من المعلومات الواردة في الاقتباس العلوي ، فإن وظائف الوحدات الفرعية المختلفة للبروتين مختلفة ولكنها مكملة. يحتوي 126 كيلو دالتون على أشكال هيلياز ونقل الميثيل ، في حين أن 183 كيلو دالتون يعمل كبوليميراز بالإضافة إلى احتوائه على نفس أشكال الهليكاز ونقل الميثيل. وجد Lewandowski و Dawson (2000) أن الوحدة الفرعية 183 كيلو دالتون كانت قادرة على أداء جميع الوظائف المذكورة أعلاه ، حيث تعمل بمثابة RdRP الكامل ، ولكن مع الوحدة الفرعية 126 كيلو دالتون ، تم تنفيذ هذه الوظائف بمعدل 10 مرات أسرع. وجدوا أيضًا أن تحور قاعدة في مجال هليكاز لـ 126 كيلو دالتون (183 كيلو دالتون مقدم من فيروس مساعد يعبر فقط عن شكل 183 كيلو دالتون) أدى إلى عدم تكرار الحمض النووي الريبي مع المتحول 126 كيلو دالتون مما يشير إلى أن هذا البروتين ضروري لـ تكرار الحمض النووي الريبي. وتجدر الإشارة هنا أيضًا وفقًا للتعليقات ، إلى أن الدليل على التغاير في الشكلين ليس في شكل بنية بلورية ، ولكن في قياس متكافئ 1: 1 في الترسيب المناعي كما تمت مناقشته في ورقة واتانابي المرتبطة أعلاه. على حد علمي ، لم ينتج أحد بنية بلورية كاملة لـ RdRP لأي فيروس توبام.

ومع ذلك ، ربما لاحظت عندما نظرت إلى المعلومات الموجودة على الرابط الذي قدمته ، أنه يبدو أن هناك حوالي 4 ORFs فقط ، وأن عددًا صغيرًا من البروتينات تم إنتاجها ، وربما تفكر في شيء ما على غرار

"كيف يمكن للفيروس أن يعمل عندما ينتج القليل من البروتينات فقط؟"

الجواب هو أن البروتينات الفيروسية تؤدي وظائف عديدة (هذه الميزة ليست خاصة بالبروتينات الفيروسية). على وجه الخصوص ، يبدو أن الوحدة الفرعية الصغيرة (126 كيلو دالتون) تعمل كقمع لنظام المضيف الذي يقوم بإسكات نظام الحمض النووي الريبي (سيرنا). تعمل أنظمة siRNA في النباتات إلى حد ما مثل استجابة الجهاز المناعي - فهي تشير داخل الخلية وخارج الخلية لتحفيز استجابة RNA الفيروسية المتدهورة ، بحيث لا يمكن للفيروس أن ينتشر بسهولة أو يثبت نفسه في المضيف. أتوقع أن ما هو أفضل مكان لقمع وظائف siRNA من موقع تكاثر الحمض النووي الريبي الفيروسي نفسه.


التغطية الخاصة بالفيروسات لفيروس فسيفساء التبغ RNA: مثيلة لـ GTP قبل تكوين المركب التساهمي p126-m 7 GMP

في تغطية mRNAs الخلوية ، يؤدي وسيط GMP-enzyme التساهمي إلى تكوين G (5 ′) ppp (5 ′) N في نهاية 5 ′ من الحمض النووي الريبي ، والذي يتم تعديله بواسطة المثيلة المحفزة بواسطة guanine-7-methyltransferase. نوضح هنا أن الأغشية المعزولة من النباتات المصابة بفيروس فسيفساء التبغ (TMV) أو الخلايا الحشرية التي تعبر عن بروتين TMV المتماثل p126 ، المركب m 7 GTP باستخدام س-ادينوسيل ميثيونين (AdoMet) كمانح للميثيل ، وحفز تكوين مركب غوانيلات-p126 التساهمي في وجود AdoMet. تم دمج مجموعة الميثيل من AdoMet في p126 ، مما يشير إلى أن المجمع يتكون من m 7 GMP-p126. وهكذا ، فإن TMV وفيروسات ألفا ، على الرغم من المسافة التطورية بينهما ، تشترك في نفس آلية السد الخاصة بالفيروس.


مقدمة

تستخدم الفيروسات ، ككائنات ملزمة ، عوامل المضيف للتراكم والانتشار في مضيفها. تشمل العدوى الناجحة بفيروس النبات الدخول والتراكم في الخلية الأولى ، والانتقال إلى الخلايا المجاورة غير المصابة ، والعدوى الجهازية من خلال الأنسجة الوعائية النباتية (Boevink and Oparka ، 2005 Epel ، 2009 Harries and Ding ، 2011 Niehl and Heinlein ، 2011 Schoelz وآخرون ، 2011 Tilsner وآخرون ، 2011). تمتلك فيروسات النبات استراتيجيات مختلفة لإصابة العوائل التي تعكس استخدامها للمسارات التنموية الحالية للمضيف الزائدة عن الحاجة وظيفيًا. لذلك فإن فهم عمليات العدوى بالفيروسات يوفر أيضًا نظرة ثاقبة للعمليات الفسيولوجية الطبيعية للمضيف. فيروس موزاييك التبغ (TMV) يشفر أربعة بروتينات وظيفية معروفة: 126 و 183 كيلو دالتون من البروتينات المرتبطة بالتكرار ، وبروتين الحركة (MP) ، والبروتين القفيص الهيكلي أو بروتين الغلاف (CP). من أجل الحصول على عدوى ناجحة ، تتعاون هذه البروتينات الأربعة متعددة الوظائف مع العديد من مكونات المضيف. الغشاء المضيف والهيكل الخلوي هياكل خلوية فرعية مهمة لعدوى TMV. تحتوي الحبيبات التي يسببها TMV أو الأجسام المتضمنة التي تحتوي على أغشية أيضًا على بروتينات مضيفة. في هذه المراجعة ، نناقش الأدوار المتغيرة للأغشية المضيفة والهيكل الخلوي وإدراج البروتينات المرتبطة بالجسم مع تقدم العدوى. يتم عرض النتائج الواردة في الأدبيات أولاً في القسم (الأقسام) حيث لوحظ التأثير على فسيولوجيا الفيروس بدلاً من المكان الذي قد يؤثر فيه بشكل إضافي على هذا النشاط. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن تأثير synaptotagmin على فسيولوجيا TMV (Lewis and Lazarowitz ، 2010) على أنه تثبيط للانتشار بين الخلايا لـ TMV MP ، على الرغم من أنه من المحتمل أن يؤثر على النقل داخل الخلايا لهذا البروتين. تم القيام بذلك للإشارة بوضوح إلى ما هو موجود في الأدبيات المنشورة بدلاً من ما قد يفسر القارئ النتائج للإشارة إليه. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، يتم ملاحظة التأثير المفترض للنتيجة المرصودة على آلية حركة الفيروس. حسب الاقتضاء ، تم ذكر النتائج من فيروسات توبامو أخرى للإشارة إلى عمومية أو خصوصية استنتاج للجنس.


جينات الفيروس وتطوره

كما ذكّر يوشيمي أوكادا (جامعة تيكيو ، أوتسونوميا ، اليابان) أولئك الذين حضروا الندوة ، لم يقبل معظم علماء الأحياء أن الجينات تتكون من الأحماض النووية حتى الخمسينيات من القرن الماضي. لعبت التجارب مع TMV دورًا مهمًا في هذا التطور من خلال توفير أول دليل قاطع على أن جزيء RNA الفيروسي - على وجه التحديد TMV RNA - كان كافياً للعدوى وحمل جميع المعلومات اللازمة لتخليق CP (Fraenkel-Conrat ، 1956 Gierer و شرام ، 1956).

تروي بيا سنجر (جامعة كاليفورنيا ، بيركلي) كيف قامت هي وفرينكل كونرات (جامعة كاليفورنيا ، بيركلي) بتوسيع البحث البيوكيميائي في علم الوراثة TMV. بدأوا بسلالات TMV التي تحدث بشكل طبيعي لإثبات أن سلالة الفيروسات المختلطة (أي البروتين من سلالة واحدة والحمض النووي الريبي من سلالة أخرى) كانت مطابقة تمامًا للحمض النووي TMV (Fraenkel-Conrat and Singer ، 1957). استخدم Fraenkel-Conrat and Singer لاحقًا حمض النيتروز المطفر (Gierer and M المقابل ، 1958) لتوليد متغيرات جديدة من TMV تمت مقارنتها فيما بعد من حيث محتواها من الأحماض النووية ، وتكوين CP ، وأعراض المرض. كانت هذه تجارب صعبة بسبب الطبيعة المتغيرة للحمض النووي الريبي TMV. كما تتذكر سنجر ، قامت هي وفرينكل كونرات بحماية الحمض النووي الريبي من الحمض النووي الريبي الخلوي عن طريق إضافة البنتونيت الطيني ، مما أدى إلى زميلهم C.A. نايت ليقول إنه "لن يضع هذا الطين في أغراضه".

أكدت سينغر أن عملها مع Fraenkel-Conrat يمثل البداية الحقيقية للكيمياء المطبقة على علم الفيروسات. ومع ذلك ، يمكن للمرء أن يشير إلى أن هذا العمل اعتمد على التطورات المتزامنة في علم الجراثيم وعلم الوراثة البكتيرية ، بدءًا من البحث الذي تم إجراؤه قبل عقد من الزمن في معهد روكفلر ، حيث أظهر أفيري وزملاؤه في الكيمياء الحيوية "مبدأ التحول" العقدية أن تكون DNA.

مع توضيح تسلسل CP الكامل في عام 1960 (Anderer et al. ، 1960 Tsugita et al. ، 1960) قدمت مجموعة طفرات TMV أدلة مستخدمة لكسر الشفرة الجينية. فقط التطور المذهل لأنظمة الترجمة الخالية من الخلايا في العام التالي بواسطة H.Mathei و M. قاموس.

تسلط طفرات TMV الضوء على أسئلة بيولوجية أخرى أيضًا. كما لاحظ سنجر أيضًا ، كانت جميع الطفرات تقريبًا المنسوبة إلى معالجة حمض النيتروز أقل "ملاءمة" من النوع البري TMV ، وهي ملاحظة توحي بالتطورات اللاحقة في ساحات تنوع الفيروس وتطوره.

ذكر ميلتون زيتلين (جامعة كورنيل ، إيثاكا ، نيويورك) كيف أن التطورات في التقنيات الوراثية الجزيئية مكنت الباحثين في السبعينيات والثمانينيات من القرن الماضي من بناء خريطة مفصلة لجينوم TMV. في الواقع ، جاء دليل مهم للتركيب الجيني للحمض النووي الريبي TMV من الدراسات التي أجريت في مختبر زيتلين والتي أظهرت أن مكونًا منخفض الوزن الجزيئي يسمى sgRNA تراكم أثناء العدوى الفيروسية (جاكسون وآخرون ، 1972). وسرعان ما تم توريط هذا sgRNA باعتباره mRNA الذي يوجه إنتاج CP (Hunter et al. ، 1976). بحلول منتصف السبعينيات من القرن الماضي ، كانت مجموعة زيتلين قد وضعت بشكل صحيح ، وإن كان مؤقتًا ، جين ترميز النسخ المتماثل في نهاية 5 ، وجين تشفير CP في نهاية 3 ، وجين ضروري للحركة الفيروسية في الجزء المركزي من الجينوم (Beachy et al. ، 1976 انظر الشكل 1). أكد Nishiguchi و Okada وزملاؤه (Nishiguchi et al. ، 1978 Ohno et al. ، 1983) أن MP-30 kD تم ترميزه بواسطة TMV باستخدام TMV سلالة L ومتغير حساس لدرجة الحرارة ، Ls-1. أكدت العديد من دراسات علم الوراثة العكسية باستخدام الحيوانات المستنسخة المعدية ، والتي تم تجميعها لأول مرة في عام 1986 (Dawson et al. ، 1986 Meshi et al. ، 1986) ، وظائف الجينات المخصصة خلال هذه الدراسات السابقة.

تمت مراجعة بدء عدوى TMV وتفكيك فيريون TMV بواسطة John G. Shaw (جامعة كنتاكي ، ليكسينغتون). بعد دخول الخلية المضيفة ، يجب على TMV virion إزالة CP الخاصة به لتمكين التكاثر الفيروسي. قدم شو نموذجًا واحدًا يصف كيف يمكن أن يحدث هذا الطلاء ثنائي الاتجاه ، بدءًا من نهايتي 5 ′ و 3 لجزيء الحمض النووي الريبي الجيني TMV. قد يكون التفاعل غير المطلي 5′ إلى 3 مترجمًا مشتركًا (ويلسون ، 1984) ، مما يؤدي إلى التفكيك بواسطة آلية تتوسط فيها الريبوسوم والحماية المصاحبة للحمض النووي الريبي الفيروسي غير المطلي من نوكليازات الخلية. اقترح شو أن تفاعل 3′-to-5 غير المطلي قد يحدث بطريقة تكوينية ، لأن طفرات النسخ المتماثلة الفيروسية المعيبة في تفكيك 3′-to-5 يمكن أن تكون غير مغلفة في البروتوبلاست النباتية عن طريق إضافة RNA الفيروسي الحر مع سلامة. الجين المتماثل (Wu and Shaw ، 1996 ، 1997). تجسد هذه الدراسات حول عدوى TMV على المستوى الجزيئي التنسيق عالي الكفاءة للأحداث المتباينة على ما يبدو المرتبطة بتكاثر الفيروس.

قام كين باك (الكلية الإمبراطورية للعلوم والتكنولوجيا والطب ، لندن ، المملكة المتحدة) بتشريح عملية تكرار TMV ، وأشار إلى أنه على الرغم من أن البروتينات الفيروسية المشاركة في تكرار TMV تتميز جيدًا ، إلا أن مشاركة العوامل المضيفة غير مفهومة جيدًا. على أساس ارتباطهم المادي ببروتينات النسخ المتماثل الفيروسي ، اقترح باك نوعين من البروتينات المضيفة المرشحة التي قد تكون متورطة في تخليق TMV RNA: EF-1α ، التي تتجمع مع مجمع النسخ المتماثل ، ووحدة فرعية من eIF-3 ، والتي تتعاون مع النسخة المتماثلة. بالإضافة إلى ذلك ، ذكر باك الأساليب الجينية لتشريح تفاعلات الفيروس مع المضيف التي أدت إلى تحديد توم -1 و توم 2 المسوخ أرابيدوبسيس و تم -1 متحولة من الطماطم ، حيث يتم تقييد تكاثر TMV.

كما أسفرت الدراسات الجينية السكانية مع فيروسات توبامو عن نتائج مفاجئة. على الرغم من أن فيروسات الحمض النووي الريبي لديها القدرة على التباين على نطاق أوسع من فيروسات الحمض النووي (دومينغو وهولندا ، 1994) ، فإن TMV توفر حالة من الاستقرار الجيني العالي. قارن Adrian J. Gibbs (الجامعة الوطنية الأسترالية ، كانبيرا) تسلسل cDNA للعزلات الحديثة من فيروس التبغ للتبغ الأخضر المعتدل (TMGMV) و TMV مع تلك المشتقة من العدوى. نيكوتيانا جلوكا تم إيداع العينات في الأعشاب الأسترالية منذ عام 1899. أفاد جيبس ​​أن هذه التحليلات تظهر أنه لم تكن هناك زيادة في التنوع الجيني لـ TMGMV في أستراليا على مدار المائة عام الماضية.علاوة على ذلك ، يبدو أن الطفرات التي لوحظت في TMV ضارة لأن TMGMV أصبح فيروس التبغ الأكثر انتشارًا في ن. جلاوكا في ذلك البلد (فرايل وآخرون ، 1997).

بشكل أكثر عمومية ، يبدو أن فيروسات توبامو من أماكن بعيدة مثل كاليفورنيا وكريت هي جزء من عدد كبير من سكان العالم مع تباين محدود للغاية. يشير هذا الاختلاف المقيد بشكل ملحوظ إلى أنه على الرغم من اختلاف الضغوط الانتقائية ، فإن الجينوم الفيروسي يظل ثابتًا بشكل عام نتيجة للتفاعلات طويلة المدى بين المضيف والفيروس. بعبارة أخرى ، يبدو أن هناك نافذة مقيدة لتغير تسلسل TMV ، والتي خارجها يتم تعزيز قدرة النبات المضيف على التعرف على هذا العامل الممرض وصده بشكل كبير. في هذا الصدد ، يبدو أن TMV مختلفة تمامًا عن الفيروسات الأخرى ، مثل الأنفلونزا وفيروس نقص المناعة البشرية ، والتي تظهر بشكل مميز معدلات عالية من تغير النوكليوتيدات. من المحتمل أن يكون التباين المقيد الذي يميز TMV في جميع أنحاء العالم قد ساعد علماء الفيروسات الأوائل ، الذين كانوا قادرين على تكرار النتائج من المختبرات البعيدة بسهولة نسبية.


مناقشة

المراحل المبكرة من عدوى TMV

يحدث تكرار العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي الموجبة الشريطية في ارتباط وثيق مع الأغشية (على سبيل المثال ، Wu et al. 1992 Molla et al. 1993 Strauss and Strauss 1994 Osman and Buck 1996). في هذه الدراسة ، تم توطين TMV vRNA بشكل خاص مع عدة أنواع من الأغشية الخلوية. في وقت مبكر من الإصابة ، ارتبط الحمض الريبي النووي الريبي (vRNA) بشبكة شبكية حول النواة وخيوط من الأنابيب والحويصلات الصغيرة. تشبه هذه الهياكل إلى حد كبير شبكة ER القشرية متعددة الأضلاع للأنابيب والألواح ذات الأجزاء الرقائقية المتداخلة المتصلة بالمغلف النووي ، الموصوف سابقًا في الخلايا النباتية (Allen and Brown 1988 Hepler et al. 1990 Staehelin 1997). إن تحديد موقع vRNA مع BiP ، وهو بروتين مقيم في ER (Denecke et al. 1995 Boston et al. 1996) وتعطيل الهياكل الفلورية بواسطة BFA (الشكل 8) ، يدعمان الفرضية القائلة بأن vRNA مرتبط بـ ER. تشير ملاحظاتنا إلى أن النسخ المتماثلة الفيروسية (Ishikawa et al. 1986) والحمض النووي الريبي التكميلي الناقص (المستخدم كقالب لتكرار vRNA) في هذه الهياكل الغشائية تشير بقوة إلى أن تكرار TMV vRNA يحدث في ارتباط وثيق مع ER. وصفت التقارير السابقة العلاقة بين مجمعات النسخ المتماثل لـ TMV والمستخلصات الغشائية من الخلايا المصابة (Watanabe and Okada 1986 Osman and Buck 1996).

تم أيضًا ترجمة الحمض النووي الريبي البسيط إلى هياكل (يُفترض أنها ER) تحيط بالنواة ، باستثناء منطقة منفصلة. يمكن أن يعكس عدم وجود RNA ناقص حبلا من هذه المنطقة تجزئة ER حول النواة ، أو قد يشير إلى أن ER مقسم إلى مجالات فرعية ذات خصائص مورفولوجية أو وظيفية محددة (Staehelin 1997). إيشيكاوا وآخرون. اقترح عام 1986 أن تركيب خيوط موجب وناقص من vRNA يتطلب أنواعًا مختلفة من العوامل أو التفاعلات الجزيئية ، وهي ملاحظة قد تكون ذات صلة بدراساتنا.

تم تحديد موقع vRNA والنسخة المتماثلة الفيروسية في بقع صغيرة يتم توزيعها في جميع أنحاء السيتوبلازم. كما هو موضح سابقًا في عدوى فيروس شلل الأطفال (Bienz et al. 1983) ، نقترح أن البقع التي تحتوي على vRNA والنسخة المتماثلة تتوافق مع مجمعات النسخ المتماثل بالاشتراك مع ER الذي يقسم المكونات المطلوبة للتكرار لتعزيز إنتاج الفيروس.

في المراحل المبكرة من الإصابة ، ارتبط الحمض الريبي النووي الريبي بخيوط الفلورسنت التي تشبه عناصر الهيكل الخلوي (غير معروض). بناءً على تأثيرات oryzalin و cytochalasin D على توزيع vRNA في السيتوبلازم ، نقترح أن هناك ارتباطًا بين vRNA والهيكل الخلوي في مرحلة مبكرة جدًا من العدوى. في هذا السيناريو ، يستغل vRNA الهيكل الخلوي للنقل من السيتوبلازم إلى مواقع حول النواة. تستند هذه الفرضية جزئيًا إلى ملاحظة أن علاج البروتوبلاست بأوريزالين في وقت التلقيح منع توطين الحمض النووي الريبي في المنطقة المحيطة بالنواة. وصف تقرير حديث آلية في الخلايا الظهارية للرئة نيوت يتم من خلالها نقل أغشية ER المتصلة بالأنابيب الدقيقة نحو مركز الخلية من خلال التدفق الرجعي القائم على الأكتوموسين للأنابيب الدقيقة مع إرفاق ER كبضائع (Waterman-Storer and Salmon 1998). باتباع هذا النموذج ، من الممكن أن يتم نقل مجمعات vRNA-replicase المرتبطة بـ ER عبر الأنابيب الدقيقة إلى مواقع حول النواة باستخدام آلية مماثلة.

طوال فترة العدوى ، تم توطين الحمض الريبي النووي الريبي (vRNA) في مقصورات خلوية مختلفة. نقترح أن هذا يعكس حركة vRNA إلى أقسام مختلفة ، ولكن لا يمكن القضاء على احتمال أن يمثل التقسيم التوليف والتدهور اللاحق لـ vRNA بدلاً من حركة vRNA من حجرة إلى أخرى.

عندما أصيبت البروتوبلاست بـ vRNA-M ، وهو طفرة من TMV لا تنتج MP ، تم ترجمة vRNA-M إلى هياكل تشبه الحويصلة حول النواة وفي بقع صغيرة في السيتوبلازم. تشير هذه النتائج إلى أنه في مرحلة مبكرة من الإصابة ، يعد الارتباط بـ ER خاصية جوهرية لـ vRNA و / أو النسخة المتماثلة ولا تتطلب MP. من الممكن أن يحتوي vRNA على تسلسلات تستهدف ER. من المعروف أن بعض mRNAs الخلوية تحتوي على إشارات محددة توجهها إلى ER الخام للترجمة (St. Johnston 1995).

أوساط العدوى: تراكم الفيروسات والنقل داخل الخلايا

في مراحل العدوى ، تم توطين الحمض الريبي النووي الريبي في أجسام متألقة غير منتظمة الشكل ، بعضها يشبه الحويصلة في المظهر. علاوة على ذلك ، فإن النسخة المتماثلة (الشكل 4) و MP (الشكل 5) تتجمع مع vRNA على هذه الهيئات. نظرًا لعدم ملاحظة مثل هذه الهياكل في البروتوبلاست المصابة بـ vRNA-M ، فإننا نستنتج أن MP مطلوب لتشكيل و / أو استقرار الأجسام. قد تتوافق هذه الهياكل مع "viroplasms أو شوائب غير متبلورة" الموصوفة سابقًا بسبب عدوى TMV (Martelli and Russo 1977). تدعم ملاحظاتنا اقتراحًا سابقًا مفاده أن مجمعات النسخ المتماثل مرتبطة بوظيفة ER الخام مثل mRNAs (Beachy and Zaitlin 1975). أثناء تركيبه ، قد يظل MP مرتبطًا بـ vRNA ، حيث يعمل كبروتين مرساة ويحاصر vRNA على الهياكل المشتقة من ER. وفقًا لذلك ، يتزامن التراكم الكبير لـ MP مع التغيرات المورفولوجية الدرامية التي تحدث في ER (Reichel and Beachy 1998).

بمرور الوقت ، تصبح الأجسام السيتوبلازمية هياكل مستطيلة ، غالبًا ما ترتبط بخيوط الفلورسنت ، موجهة نحو محيط الخلية. يوفر التحصين بالأجسام المضادة للأليوبيولين وتفاعلات التهجين في الموقع دليلًا واضحًا على تكوّن الحمض النووي الريبي (vRNA) مع الأنابيب الدقيقة. منع علاج البروتوبلاستس في منتصف مرحلة العدوى بأوريزالين تشتت الأجسام إلى محيط الخلية ، مما يشير إلى أن الأنابيب الدقيقة تلعب دورًا في توزيع الحمض النووي الريبي داخل الخلايا. تشارك آليتان مختلفتان تعتمدان على الأنابيب الدقيقة ، وهما الانزلاق الغشائي ومجمعات التعلق بالطرف ، في حركة ER من مركز الخلية إلى محيط الخلايا الظهارية للرئة نيوت (Waterman-Storer and Salmon 1998). في عدوى TMV ، يمكن نقل المجمعات التي تحتوي على MP و vRNA و replicase المرتبطة بـ ER نحو محيط الخلايا باستخدام هذه الآليات.

أدى علاج البروتوبلاست المصابة بالسيتوشالاسين D إلى تغيير نمط توزيع الحمض النووي الريبي (vRNA) بشكل واضح وتسبب في تأخير ظهور الأجسام الكبيرة ، مما يشير إلى دور الميكروفيلامين في تكوينها و / أو استقرارها. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي إزالة البلمرة للأنابيب الدقيقة أيضًا إلى تعطيل الخيوط الدقيقة (Panteris وآخرون 1992) ، لذلك من الصعب تحديد الدور المحدد لكل مكون هيكلي خلوي في الانتشار داخل الخلايا لـ vRNA.

لم يكن vRNA-M مرتبطًا بعناصر الهيكل الخلوي إلا إذا عولجت الخلايا في المراحل المبكرة من العدوى بالخلية Cytochalasin D. أدى هذا العلاج إلى تراكم vRNA-M في البقع الفلورية في محيط الخلية ، وكذلك على الخيوط التي كانت مشابهة في مظهر الأنابيب الدقيقة. تشير هذه النتائج إلى أن vRNA كان مرتبطًا بالأنابيب الدقيقة عند غياب كل من MP والألياف الدقيقة. تم وصف نقل mRNAs على طول مكونات الهيكل الخلوي في مجموعة متنوعة من الأنظمة البيولوجية ، خاصة فيما يتعلق بتمايز الخلايا وتطورها (Ferrandon et al. 1994 Kloc and Etkin 1995 Ainger et al. 1997 Broadus et al. 1998). في تلك الحالات ، تضمنت آليات نقل الحمض النووي الريبي تسلسلات محددة في المنطقة غير المترجمة 3 التي تتعرف عليها البروتينات التي تربط هذه التسلسلات وتتوسط في التفاعل مع الهيكل الخلوي (Oleynikov and Singer 1998). في دراستنا ، كان التغيير في نمط توزيع الحمض النووي الريبي الناجم عن السيتوكالاسين D أكثر وضوحًا في البروتوبلاست المصابة بـ vRNA-ΔM مقابل وزن vRNA. تشير هذه البيانات إلى بعض تأثير MP في توطين vRNA في البروتوبلاست المعالجة بالخلوي D. نناقش أدناه آثار MP والألياف الدقيقة في تكوين وترسيخ الأجسام السيتوبلازمية.

المراحل المتأخرة من العدوى: انتشار الفيروس و / أو تدهوره؟

طوال فترة العدوى ، تم توطين vRNA حول النواة ، على الرغم من أنه في المراحل المتوسطة والمتأخرة ، تم أيضًا تفريق الحمض النووي الريبي في جميع أنحاء السيتوبلازم وفي محيط الخلية. قد يؤدي تراكم vRNA حول النواة إلى تسهيل الارتباط بمكونات المضيف المطلوبة لعدوى الفيروس. ومع ذلك ، فإن تراكم الأجسام الأكبر بكثير التي تحيط بالنواة قد ينطوي على دور بيولوجي مختلف في التكرار. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح نموذج يمكن من خلاله للبروتينات المشوهة التي تهرب من مسار التحلل الذي يتوسطه البروتينات أن تتجمع لتشكل هياكل كبيرة ، يُشار إليها باسم "aggresomes". يتم نقل Aggresomes على الأنابيب الدقيقة من المواقع الطرفية إلى موقع نووي غني باليوبيكويتين في مركز تنظيم الأنابيب الدقيقة ، حيث تتشابك مع خيوط وسيطة منهارة (Johnston et al. 1998). باتباع هذا النموذج ، أثناء عدوى TMV ، يمكن نقل الأجسام التي تحتوي على MP و vRNA و replicase على الأنابيب الدقيقة حتى تتحلل. في دراسات أخرى حديثة ، وصفنا انتشار MP ودور البروتينات في تدهور MP (C. Reichel و RN Beachy ، مخطوطة مقدمة للنشر).

في المراحل المتأخرة من العدوى ، تم توطين الحمض الريبي النووي الريبي في الهياكل التي تبرز من سطح الخلية. لم تتعطل هذه النتوءات بواسطة oryzalin أو cytochalasin D. علاوة على ذلك ، في دراسات أخرى ، لاحظنا أن النتوءات كانت ملطخة بـ DiOC6(3) (3 ، 3′-dihexyloxacarbocyanine iodide) ، صبغة فلورية حيوية من ER (غير معروض). تشير دراسات أخرى إلى أن هذه الهياكل المحتوية على ER لا تسببها عدوى الفيروس في حد ذاتها ، ولكن يمكن تحفيزها عن طريق العدوى (P. Más و R.N. Beachy ، مخطوطة قيد الإعداد). نقترح أن الهياكل البارزة مرتبطة بأنابيب ديسموتيبول ، ER المكبوت الذي يشتمل على المكون المركزي للصفائح المتصاعدة (Lucas et al. 1993). بدلاً من ذلك ، يمكن أن تكون نتيجة لتلف الخلايا في المراحل المتأخرة من العدوى ، مما يؤدي إلى قذف ER عبر غشاء البلازما. ومن المثير للاهتمام ، أن vRNA-M لم يكن مرتبطًا بالنتوءات ، مما يشير إلى دور MP في توطين vRNA مع هذه الهياكل. معًا ، قد تشير هذه النتائج إلى وجود نوعين مختلفين على الأقل من ER متورطان في عدوى TMV. نوع واحد من ER يشارك في تكرار vRNA ولا يتطلب وجود MP. النوع الثاني يتوافق مع النتوءات الخيطية التي قد تكون متورطة في الانتشار بين الخلايا للفيروس وتتطلب MP وظيفية.

نموذج لعدوى TMV

تتوافق البيانات المقدمة هنا وفي المنشورات السابقة مع نموذج عدوى TMV (الشكل 11) حيث يحدث تكرار vRNA في ارتباط وثيق مع أغشية ER (الشكل 11 ، الشكل 1). في هذا النموذج ، تشارك عناصر الهيكل الخلوي في استهداف مجمعات vRNA / المتماثلة إلى ER حول النواة ، ربما عبر تدفق رجعي للأنابيب الدقيقة مع إرفاق ER كبضائع. تعمل vRNAs الوليدة المرتبطة بـ ER في مجمعات النسخ المتماثل مثل mRNAs لتخليق MP (الشكل 11 ، الشكل 2). يظل MP مرتبطًا بـ vRNA في المجمع ، مما يؤدي إلى تكوين هياكل كبيرة مشتقة من ER (الشكل 11 ، الشكل 3). في هذه المرحلة ، سيتم تحديد توزيع الحمض النووي الريبي (vRNA) من خلال التوازن بين تكوين الهياكل الكبيرة وتثبيتها وانتشارها نحو محيط الخلية. تتوافق نتائجنا مع النموذج الذي تشارك فيه MP والألياف الدقيقة في تكوين وترسيخ الهياكل المشتقة من ER (الشكل 11 ، الشكل 3) ، بينما تشارك الأنابيب الدقيقة في النقل إلى وجهاتها النهائية ، أي إلى الأطراف للانتشار بين الخلايا ، أو نحو النواة للتحلل (الشكل 11 ، الشكل 4).

عدة أنواع من الأدلة التجريبية تدعم هذا النموذج. أولاً ، هناك تأثير كبير على توزيع vRNA-M في البروتوبلاستات المعالجة بالخلوي D. لم يتم العثور على الأجسام فقط في هذه البروتوبلاست ، على عكس وزن vRNA ، ولكن تم العثور على vRNA-M على أو بالقرب من محيط الخلية ولكن ليس في النتوءات من غشاء البلازما. نظرًا لعدم توطين vRNA-M في البروتوبلاست غير المعالجة في الأطراف في المراحل المبكرة من العدوى ، فإن الانتشار داخل الخلايا الذي يحدث عادةً في وقت لاحق في العدوى قد تسارع على ما يبدو في غياب الألياف الدقيقة. ثانيًا ، من شأن الارتباط الواضح بين vRNA-M والأنابيب الدقيقة أن يفسر دور الأنابيب الدقيقة في الانتشار داخل الخلايا للفيروس نحو محيط الخلية. ثالثًا ، في المراحل المتأخرة من العدوى ، تشرح العلاقة الوثيقة بين ER والأنابيب الدقيقة ارتباط vRNA في وجود MP إلى مقدمة من plasmodesmata (الشكل 11 ، الشكل 5) التي من شأنها أن تؤدي إلى الخلية إلى - انتشار الفيروس في أنسجة الأوراق.


استنتاج

تم تحديد طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وفعالة لإصابة النباتات بنواقل TMV عن طريق العدوى الزراعية. مستويات التعبير عن البروتين المؤتلف من حوالي 600 إلى 1200 ميكروغرام لكل جرام من A. الورم تم الحصول على الأنسجة النباتية المتسللة. يمكن استعادة البروتين المؤتلف من كل من الأوراق الملقحة محليًا أو من الأنسجة النباتية المصابة جهازيًا. يجب أن تمكّن هذه التحسينات الباحثين الذين لديهم خبرة قليلة أو معدومة مع ناقلات فيروسات النبات من استخدام ناقلات تعبير TMV بسهولة في أبحاثهم. ستكون تحسينات المتجه الموصوفة هنا مفيدة بشكل خاص في مشاريع البحث عالية الإنتاجية.


مناقشة

تحتاج النباتات ، ككائنات لاطئة ، إلى الاستجابة للضغوط الحيوية أو اللاأحيائية عن طريق إعادة ضبط مستويات وفرة بروتينات معينة لها دور حاسم في الضغوط. يمكن أن يؤدي التنظيم المنسق لأعلى ولأسفل لعوامل مضيفة معينة في الفيروس والتفاعل # x2013plant إلى رد فعل دفاعي ضد الفيروس. بدلاً من ذلك ، يمكن للمرء أن يفترض أن مثل هذه التغييرات في العوامل المضيفة ستفيد الفيروس الغازي في تفاعل متوافق. تشير الأدبيات إلى أن تغييرات البروتين مرتبطة بدور دفاعي مفترض ضد عدوى TMV في التبغ ، بينما ترتبط تغييرات البروتين الأخرى بعدوى TMV الناجحة في الأمراض المسببة للتبغ. حدد تحليل البروتينات لدينا 661 بروتينًا. يحتوي التبغ على قاعدة بيانات بروتينية غير مكتملة حتى الآن (6793 مدخلًا) ومعدل مشروح منخفض يمكن أن يفسر معدل التعريف المنخفض. يتطلب استخدام البروتينات الخالية من الهلام لتحديد البروتين قاعدة بيانات مشروحة جيدًا للأنواع المضيفة قيد الدراسة حتى تتمكن من تحديد العديد من البروتينات.

على الرغم من العدد المنخفض نسبيًا للبروتينات التي تم تحديدها ، وجدنا ارتباطًا كبيرًا مع العلاجات المختلفة. تم العثور على ستة وثلاثين (36) بروتينًا متراكمًا بشكل تفاضلي في التفاعل المتوافق مع التبغ & # x2013TMV في وقت مبكر يصل إلى 15 ميغا بكسل في البوصة. تتضمن التغييرات البروتينية التي يمكن أن تساهم في مقاومة TMV البروتينات المرتبطة بالدفاع مثل S-adenosylmethionine synthase ، ومثبط بروتين السيستين ، وجلوتاثيون S-ترانسفيراز ، ونزعة هيدروجين المالات ، و Snakin-1 ، وبروتين شبيه بالأوزموتين ، و RNA المرتبط بالجليسين الغني بالجليسين. البروتين (المنتظم عند عدوى TMV) ، بالإضافة إلى عوامل الحساسية المفترضة مثل كينازات الفوسفوجليسيرات والبروتين الشبيه بـ OBERON (الخاضع للتنظيم عند عدوى TMV) (الجدول 1).

يحفز S-adenosylmethionine synthase أو SAMS (A0A0F7R532) تكوين S-methylmethionine (SMM) ، وهو أمر ضروري لإنتاج العديد من البروتينات الواقية للتضخم (Espartero et al. ، 1994). يمكن أن تساهم المستويات المرتفعة من SMM في الاستجابة ضد إجهاد النبات ، حيث إنها مقدمة مباشرة لعائلة البروتينات التي تحتوي على مادة السلفونوبروبيونات النشطة في آليات الدفاع الحيوية وغير الحيوية. يؤثر SMM أيضًا على التخليق الحيوي للمركبات التنظيمية والدفاعية مثل البولي أمينات والإيثيلين (Tassoni et al. ، 2008). يلعب مثبط بروتين السيستين (A0A075F933) دورًا مفترضًا في الدفاع عن النبات ضد الالتهابات الفيروسية (Shih et al. ، 1987 Prins et al. ، 2008). جوتيريز كامبوس وآخرون. (1999) عبر عن مثبطات إنزيم بروتياز السيستين في التبغ المعدّل وراثيًا يمنح مقاومة ضد فيروسات البوت. يشارك Glutathione S-transferase أو GST (Q4LB98) في معادلة المركبات السامة وأنواع الأكسجين التفاعلية التي تشكلت أثناء الإصابة بالفيروس (Zechmann et al. ، 2005). في حالة فيروس فسيفساء الخيزران، GST النبات يرتبط بـ RNA الفيروسي الذي ينقل الجلوتاثيون إلى مجمع التكاثر الفيروسي (Chen et al. ، 2013). الجلوتاثيون هو منظم رئيسي لإشارات الأكسدة والاختزال والتخزين المؤقت ويلعب دورًا مهمًا في الدفاع عن النبات من خلال تنشيط الجينات المتعلقة بالدفاع (Foyer and Noctor ، 2009). يحفز Malate dehydrogenase (A0A075F1V0) بشكل عكسي تحويل oxaloacetate إلى malate في كل من الميتوكوندريا والسيتوبلازم ، مما يؤدي إلى إنتاج مستقلبات ثانوية (Tomita et al. ، 2005) ، مثل القلويات ، والفلافونويد ، والتربينويد ، والتي يتم تصنيعها في رد فعل التلف الميكانيكي أو العدوى (Beggs and Wellman ، 1994). ارتبط الببتيد المضاد للميكروبات Snakin-1 أو SN1 (A0A0R4WFT2) بمقاومة معززة ضد البكتيريا والفطريات والفيروسات (Almasia et al. ، 2008 Rong et al. ، 2013 He et al. ، 2017). تم العثور على جين SN1 لفول الصويا لتعزيز مقاومة الفيروسات في أرابيدوبسيس وفول الصويا ربما عن طريق تغيير التعبير عن جينات توصيل الإشارات والاستجابة الدفاعية (He et al. ، 2017). ينتمي البروتين الشبيه بالأوزموتين (A0A075EZS9) إلى عائلة البروتينات المرتبطة بمسببات الأمراض (PR-5) مع دور دفاعي مفترض ضد العديد من مسببات الأمراض ، إلى جانب دوره كمنظم تناضح. تم الإبلاغ عن وفرة أعلى من البروتينات الشبيهة بالأوزموتين في أنسجة الأوراق المصابة بـ TMV (Broekaert et al. ، 1997).يشارك بروتين ربط الحمض النووي الريبي الغني بالجليسين أو GRP (J7G1D7) في تفاعلات المضيف & # x2013 الممرض ، وله دور في ارتباط الحمض النووي ، والاستجابة شديدة الحساسية ، والتخليق الحيوي لحمض الساليسيليك (Naqvi et al. ، 1998). الإفراط في التعبير عن A. thaliana منح البروتين 7 المرتبط بالـ RNA الغني بالجليسين (AtGRP7) مقاومة ضد TMV (Lee et al. ، 2012). علاوة على ذلك ، فإن ربط البروتين الدهني ADP للبروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي يضعف مناعة المضيف من خلال التأثير على استقلاب الحمض النووي الريبي ونسخة النبات المتعلقة بالدفاع (فو وآخرون ، 2007).

تم إثبات أن كينازات الفوسفوجليسيرات أو PGKs (Q42961 ، Q42962) تعزز تكرار العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي الإيجابية (Cheng et al. ، 2013 Chen et al. ، 2017 Prasanth et al. ، 2017). يمكن تحقيق ذلك إما من خلال نشاط توليد ATP الذي يسهل إنشاء مجمعات التكاثر الفيروسي (VRCs) (Prasanth et al. ، 2017) أو من خلال قدرتها على ربط الحمض النووي الريبي الفيروسي التي تساعد على نقل الحمض النووي الريبي الفيروسي داخل البلاستيدات الخضراء للتكرار ( Cheng et al.، 2013). ومن المثير للاهتمام أن طفرة تحدث بشكل طبيعي لـ PGK في A. thaliana يُظهر مقاومة لفيروس بوتيفيروس ، مما يشير إلى أن PGKs قد تعمل كعوامل مضيفة تزيد من قابلية الإصابة بالفيروس (Ouibrahim et al. ، 2014). تبين أن البروتين الشبيه بأوبرون (Q84N38) يعزز الانتشار الجهازي لفيروس بوتي فيروس فسيفساء اللفت (TuMV) عبر التفاعل مع البروتين الفيروسي Vpg. يقلل تنظيم البروتين الشبيه بـ OBERON من الإصابة بـ TuMV (Dunoyer et al. ، 2004).

تشارك جميع البروتينات الموصوفة أعلاه ، والتي تم تحديدها من خلال تحليل البروتينات ، في جهود المضيف للدفاع عن نفسه ضد TMV في مرحلة مبكرة جدًا من الإصابة ، ومع ذلك ، دون نجاح لأن النباتات مصابة بشكل منهجي بالفيروس. تتضمن تغييرات البروتين المرتبطة بعدوى TMV الناجحة بروتين ربط poly-A المرتبط بالترجمة (يتم تنظيمه عند الإصابة بـ TMV) ، بالإضافة إلى العوامل المرتبطة بالبلاستيدات الخضراء مثل أنهيدات الكربون ، وبروتين bO4 لنظام ضوئي للبلاستيدات الخضراء ، و RuBisCO Activase 2 (يتم تنظيمه وفقًا للتنظيم. عدوى TMV) (الجدول 1 والشكل 2).

قد يعمل بروتين ربط Poly-A أو PABP (I2FJN7) كعامل مضيف حساسية من خلال تعزيز ترجمة الحمض النووي الريبي الفيروسي (Iwakawa et al. ، 2012). يحتوي TMV 3 & # x2032 UTR على العديد من التسلسلات الفريدة المعينة كعنصر مُحسِّن ترجمة مستقل عن CAP (CITE) ومتواليات A-rich (ARS) التي تتوسط في ترجمة RNA الفيروسية.

تم التعرف على أنهيدراز الكربون أو إنزيمات CA (EC 4.2.1.1) (A0A077DCK9 ، A4D0J8 ، A4D0J9 ، P27141) على أنها بروتينات مرتبطة بحمض الساليسيليك مع دور مضاد للأكسدة وتشكل عمومًا جزءًا من آلية الدفاع في نباتات C3 عند مهاجمتها من قبل مسببات الأمراض المختلفة ، بما في ذلك الفيروسات (Slaymaker et al. ، 2002 Restrepo et al. ، 2005). أظهر بروتين مجموعة PsbO D1 (I0B7J4) وفرة أقل بشكل ملحوظ في أصناف التبغ الحساسة لـ TMV عند الإصابة بـ TMV مقارنةً بالأصناف التي تتحمل TMV ، مما يشير إلى أن مستويات D1 المرتفعة مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بمقاومة مضادات الفيروسات (Wang et al. ، 2016) . بالإضافة إلى ذلك ، فإن إسكات PsbO في بنثاميانا أدى إلى زيادة تراكم TMV (أبينك وآخرون ، 2002). تشارك بروتينات PsbO في التحكم في تقارب النظام الضوئي II (PSII) للمنغنيز (Mn 2+) ، وبالتالي تشارك في تثبيت مجمع تطور الأكسجين (Popelkova et al. ، 2008). يعتبر مجمع PSII السليم والتشغيلي أمرًا بالغ الأهمية لمقاومة عدوى TMV (Wang et al. ، 2016). ومن المثير للاهتمام ، أن بروتين هيليكاز TMV p126 يتفاعل مع بروتين PsbO في نظام خميرة هجينين مما يشير إلى أن p126 قد يقاطع موقع و / أو وظيفة PsbO & # x2019s الطبيعية (Abbink et al. ، 2002 Wang L. Y. et al. ، 2012). عمليات تنشيط RuBisCO أو RCAs (Q40565 ، V9INR4) ، كونها بروتينات شبيهة بالمرافق ، مطلوبة لتحسين التمثيل الضوئي وتم العثور عليها مع النسخ المتماثلة TMV داخل VRCs عند إصابة TMV. يؤدي تقليل تنظيم RCA إلى زيادة الإصابة بـ TMV بشكل كبير (Bhat et al. ، 2013). البلاستيدات الخضراء هي مولدات للطاقة ، وأجهزة استشعار الإجهاد ، ومنتجي إشارات الدفاع ، وبالتالي تشكل أهدافًا رئيسية لغزو الفيروسات لتأسيس عدوى ناجحة (Li et al. ، 2016 Bhattacharyya and Chakraborty ، 2018). النتائج التي توصلنا إليها والتي تظهر الانخفاض في مستويات البروتين CA و PsbO و RCA عند 15 ميلا في البوصة يمكن أن تمثل بداية تغيير سريع للبلاستيدات الخضراء التي تسببها TMV (الجدول 1 والشكل 2). ترتبط أعراض مرض TMV النموذجية على أوراق التبغ مثل الفسيفساء ببنية غير طبيعية للبلاستيدات الخضراء وتشوه آلية التمثيل الضوئي (Lehto et al. ، 2003).

يعتبر RNAi آلية فعالة للغاية مضادة للفيروسات (Padmanabhan et al. ، 2009 Wang M.B et al. ، 2012). بالإضافة إلى ذلك ، تم اقتراح أن الرنا المزدوج الجديلة يمكن أن يحفز مسار إشارات مناعي (PTI) في النباتات التي توفر دفاعًا مضادًا للفيروسات (Niehl et al. ، 2016 والمراجع الواردة فيه). لم يتم الإبلاغ عن أي دراسات تتعلق بإنتاج vsiRNAs من جينوم TMV في وقت مبكر يصل إلى 15 mpi. يعمل Tobacco RNAi ضد TMV في هذه المرحلة الزمنية في تفاعل التبغ & # x2013TMV ، حيث يتم إنتاج vsiRNAs من اتجاه الإحساس والتوجيه المضاد للتأثير لجينوم TMV (الشكل 4 والجدول التكميلي 5). ومع ذلك ، حتى رد الفعل الدفاعي هذا لا يكفي لمنح المقاومة لأن جميع نباتات التبغ أصيبت بالعدوى. لتعزيز آلية RNAi المضيفة ، استخدمنا التطبيق الموضعي لـ dsRNAs ، كمحفزات للتلقيح القائم على الحمض النووي الريبي (Voloudakis et al. ، 2018). في العمل الحالي ، استخدمنا RNA NGS الصغيرة لإظهار أن dsRNAp126 المطبق خارجيًا على نباتات التبغ تتم معالجته بكفاءة في وقت مبكر يصل إلى 15 ميجا باسكال ، مما ينتج siRNAs المستمدة من المنطقة بأكملها من جزيء dsRNA المستخدم (الشكل 3 والجدول التكميلي 4) ، وهذا على حد علمنا تم الإبلاغ عنه لأول مرة. نظرًا لأن ملفات تعريف siRNA متشابهة في علاجات TMV و dsRNAp126 (الشكل التكميلي 3) ، فإننا نفترض أن DCLs تلعب دورًا رئيسيًا في تقطيع dsRNA المطبق خارجيًا. يمكن أن يُعزى عدم التجانس الملحوظ في إنتاج siRNA (النقاط الساخنة) (الشكل 3) إلى الهياكل الثانوية لجزيئات dsRNA التي قد تقيد إمكانية الوصول إلى بروتينات DCL إلى أهدافها. TMV عبر يمكن أن يتداخل بروتين p126 ، الذي يمتلك نشاط مثبط إسكات الحمض النووي الريبي ، مع قدرة التكعيب لبروتينات DCL المضيفة ، مما يؤثر نتيجة معالجة dsRNA المطبقة خارجيًا. ومع ذلك ، لا يبدو أن هذا يحدث في نظامنا التجريبي. على وجه الخصوص ، أنتج التطبيق الموضعي المتزامن لـ dsRNAp126 جنبًا إلى جنب مع TMV نفس النمط من جزيئات siRNA في المنطقة 426 & # x20131،091 nt (منطقة dsRNA) (الأشكال 3 و 5 والشكل التكميلي 2) ، مما يشير إلى أن وجود لا يغير الفيروس نمط التكعيب الخاص بـ dsRNA المطبق. إن siRNAs المنتجة ، عند 15 ميغا بكسل في البوصة ، في منطقة dsRNAp126 (426 & # x20131،091 nt) هي زيادة كبيرة بالنسبة إلى vsiRNAs المستمدة من بقية الجينوم الفيروسي (الشكل 5 والجدول التكميلي 6). هذه الوفرة العالية من siRNAs المشتقة من dsRNA هي معلمة مهمة جدًا للتلقيح القائم على الحمض النووي الريبي ، حيث تم إثبات فعالية RNAi سابقًا على أنها تعتمد على الجرعة (Tenllado و D & # x00EDaz-Ru & # x00EDz ، 2001). يمكن توضيح فعالية تطبيق dsRNAp126 ضد عدوى TMV من خلال اكتشاف أنه يقلل بشكل كبير من تراكم TMV ، كما يتضح من تحليل RT-PCR (الشكل 6).

1-أمينوسيكلوبروبان-1-كاربوكسيلات أوكسيديز 2 أيزوفورم A (ACO2) (E5LCN0) ، سينثيز السيستين (CyS) (Q3LAG5 ، S6A7M4) ، والأشكال الإسوية للكالودولين (CaM) (Q76ME6 ، Q76MF3) تشكل مجموعة صغيرة بشكل كبير من البروتينات أكثر وفرة في علاج dsRNAp126 + TMV عند مقارنته بالمياه وعلاجات TMV. نحن نفترض أن هذه البروتينات يتم تحفيزها بواسطة الرنا المزدوج الجديلة نفسها. لا توجد تقارير ببليوغرافية تتضمن ACO2 و CyS في عدوى فيروس النبات. ومع ذلك ، فإن البروتين الشبيه بالكالودولين (rgd-CaM) يقمع فيروس فسيفساء الخيار -2 ب (CMV-2b) ، مثبط إسكات الفيروس ، عن طريق الارتباط المادي بمجال ربط الحمض النووي الريبي النووي الريبي CMV-2b & # x2019s (Nakahara et al. ، 2012). سيكون من المهم إجراء مزيد من التحقيق في تراكم هذه البروتينات لتأكيد مشاركتها في مسار RNAi للنبات ومقاومة عدوى الفيروس.


تحليل الهيكل والوظيفة ن

وجود الزخارف الهيكلية TIR و NB و LRR في ن يشير الجين إلى أنه متورط في مجمعات البروتين التي تتعرف على رابط TMV وتحفز نقل الإشارة مما يؤدي إلى الاستجابة الدفاعية. يشير الحذف والطفرات الموجهة من الموقع لبقايا الأحماض الأمينية الرئيسية في هذه المجالات الثلاثة إلى أن المجالات الثلاثة كلها مطلوبة من أجل ن وظيفة (دينيش كومار وآخرون. ، 2000). معظم طفرات الحذف في الإطار في ن ألغى الجين مقاومة TMV وكان متنحيًا للنوع البري ن-وظيفة الجين. أظهرت طفرات حذف TIR النمط الظاهري السلبي السائد في النوع البري NN معرفتي.

ال نكما تميز مجال TIR باستهداف تسعة أحماض أمينية في هذا المجال محفوظة في النبات ص الجينية ، وكذلك في منتجات ذبابة الفاكهة والحصيلة البشرية ، و IL-1R البشري (Rock وآخرون. ، 1998). هذه الأحماض الأمينية ضرورية لتنشيط أحداث الإشارات في مسارات Toll و IL-1R. تسببت بعض بدائل الأحماض الأمينية داخل مجال TIR في خسارة كاملة لـ ن وظيفة (دينيش كومار وآخرون. ، 2000). على سبيل المثال ، على الرغم من أن طفرة الاستبدال D46Y لم يكن لها أي تأثير على ن وظيفة ، D46H أدى إلى عدم وظيفية ن. وبالمثل ، أدت البدائل المحافظة أو غير المحافظة في المواضع Y12 و Q67 و W82 و I138 و W141 و R142 إلى فقدان جزئي في النمط الظاهري للوظيفة. لم يظهر الاستبدال Y12F أي تأثير بينما كان توقيت ومظهر HR مختلفًا في النباتات التي تحمل طفرة Y12S. بصرف النظر عن توقيت أو ظهور الموارد البشرية ، طورت كل هذه الطفرات النمط الظاهري SHR. تصرفت بعض أليلات فقدان الوظيفة وفقدان الوظيفة الجزئي بطريقة سلبية سائدة وتداخلت مع النوع البري ن وظيفة. كانت إحدى النتائج الحاسمة لهذه الدراسات أن الطفرات التي تؤثر ذبابة الفاكهة تم العثور أيضًا على إشارات حصيلة أو إشارات IL-1R البشرية للتأثير على ناستجابة مقاومة بوساطة لعدوى TMV. ومع ذلك ، فإن الدور الدقيق لل نلا يزال مجال TIR في إشارات مقاومة TMV غير معروف.

إن مجال NB الخاص بـ ن الجينات وغيرها ص تشترك الجينات في تجانس تسلسل الأحماض الأمينية مع مناطق جينات موت الخلايا ، CED4 في C. ايليجانس و أباف 1و FLASH و CARD4 و Nod1 من البشر (van der Biezen and Jones، 1998 Arvind وآخرون، 1999). تم العثور على المجال NB أيضًا في مجموعة RAS و ATPases وعوامل الاستطالة وعائلات البروتين G-Protein (Saraste وآخرون. ، 1990). تعمل هذه كمفاتيح جزيئية في وظائف خلوية مختلفة ، مثل النمو والتمايز. تم تقييم دور منطقة NB في مسار مقاومة TMV من خلال إدخال طفرات 20 نقطة في سبعة أحماض أمينية محفوظة عبر ثلاثة نطاقات فرعية من NB: P-loop (kinase1) و kinase2a و kinase3 (Dinesh-Kumar وآخرون. ، 2000). أي استبدال في G216 أو K222 الثابت P-loop من N أدى إلى فقدان المقاومة. تجدر الإشارة إلى أن الطفرات في الأحماض الأمينية G12 و G13 في RAS تلعب دورًا مهمًا في التحول الجيني وتعرض هذه المسوخات نشاط GTPase المنخفض. المقابلة الطفرات في ن-الجين ، عند البقايا G218 و G219 ، أدى إلى فقدان جزئي أو كامل للوظيفة. ومن المثير للاهتمام أن بعض هذه المسوخات هي المهيمنة على النوع البري ن أليل. من المعروف أن مجموعة الهيدروكسيل من السيرين أو الثريونين في الحلقة P متورطة في ارتباط Mg 2+ المرتبط بالنيوكليوتيدات المرتبطة (Pai وآخرون. ، 1990). استبدال T223S في موقع ربط Mg 2+ المفترض لـ ن أدى الجين إلى النمط الظاهري لفقدان جزئي للوظيفة. كان توقيت ظهور وحجم ضربات القلب طبيعيًا ، لكن TMV انتشر في جميع أنحاء النبات وأدى إلى موت النبات بأكمله في غضون 5-7 أيام. ومن المثير للاهتمام أن استبدال T223 بالأسبارجين أو الألانين أدى إلى فقدان ن وظيفة ، مما يؤدي إلى أعراض الفسيفساء. ومع ذلك ، فإن هذه الأليلات هي المهيمنة على ن استجابات الموارد البشرية والمقاومة التي يسببها الجين. على الرغم من متطلبات المجال NB لوظيفة مقاومة المرض ، لا يوجد دليل كيميائي حيوي لدعم الارتباط المباشر للنيوكليوتيدات بمجال NB لبروتينات R.


النتائج

يسبب TMV-RNA الالتهام الذاتي في خلايا هيلا

تعداء TMV-RNA إلى خلايا هيلا

نظرًا لعدم وجود مستقبل لـ TMV على الأغشية الخلوية البشرية ، لم يكن TMV قادرًا على دخول خلايا هيلا عندما تمت زراعة TMV بشكل مشترك مع خلايا هيلا ، ولم يتم اكتشاف CP في خلايا هيلا. لاستيراد جزيئات TMV السليمة أو TMV-RNA إلى خلايا هيلا ، استخدمنا طريقتين: التثقيب الكهربائي أو تعداء الجسيم الشحمي ، على التوالي. بعد إجراء التثقيب الكهربائي [27] ، تم تحويل جسيمات TMV السليمة إلى خلايا هيلا بواسطة صدمة كهربائية بجهد كهربائي مختلف (0 ، 140 ، 280 و 360 فولت). أظهرت نتائج النشاف الغربي أن هناك قدرًا أكبر قليلاً من تعبير CP في خلايا هيلا المعالجة بـ 280 فولت مقارنة مع الفولتية الأخرى ، ولكن ليس مرتفعًا بدرجة كافية في تعبير CP (الشكل 1 أ-أ). تشير هذه النتيجة إلى أن بعض الخلايا ربما تكون قد تضررت بشكل قاتل بسبب التيارات الكهربائية القوية. وهكذا توصلنا إلى أن التثقيب الكهربائي لم يكن الطريقة المناسبة لترنسفكأيشن TMV. أظهرت التقارير الأخيرة أن طريقة تعداء الجسيمات الشحمية أكثر فعالية وأقل سمية للخلايا من طرق تعداء أخرى [28]. وهكذا استخدمنا هذه الطريقة لترنسفكأيشن TMV-RNA. تم تحضين خلايا هيلا بمزيج من TMV-RNA والجسيمات الشحمية بنسب 1: 1 و 1: 2 لمدة 6 ساعات. أظهر تحليل اللطخة الغربية أن CP تم إنتاجه بكثرة بنسبة 1: 1 من 1: 2 (الشكل 1 أ-ب) ، مما يشير إلى أنه يمكن نقل TMV-RNA بشكل فعال إلى خلايا هيلا باستخدام نسبة متساوية من الجسيمات الشحمية. علاوة على ذلك ، لم يتغير شكل الخلايا أثناء عملية الحضانة. وهكذا وجدنا طريقة فعالة لاستيراد TMV-RNA إلى خلايا هيلا ، وتم تطبيق هذه التقنية حصريًا في التجارب التالية.

TMV-RNA يحث على الالتهام الذاتي في خلايا هيلا

(أ) تعداء TMV أو TMV-RNA إلى خلايا هيلا. (أتم نقل TMV إلى خلايا هيلا عن طريق التثقيب الكهربائي بجهد 0 ، 140 ، 280 و 350. تم إجراء النشاف الغربي لـ TMV CP باستخدام محلولات من خلايا هيلا المنقولة بواسطة TMV لمدة 24 ساعة. (ب) تم نقل TMV-RNA (T-RNA) إلى خلايا هيلا باستخدام الجسيمات الشحمية بنسب 1: 1 و 1: 2 (T-RNA / Lipo) تم استخدام خلايا هيلا المعالجة بالجسيمات الشحمية فقط (ليبو) كعنصر تحكم سلبي وتلك تم استخدام TMV من النوع البري كعنصر تحكم إيجابي. تم إجراء النشاف الغربي لـ CP باستخدام lysates من خلايا TMV أو خلايا هيلا المنقولة لمدة 24 ساعة. تم الكشف عن المزيد من CP بنسب 1: 1 من 1: 2. وهكذا كان ترنسفكأيشن الجسيم الشحمي لـ TMV-RNA أكثر فعالية وأقل سمية لخلايا هيلا من التثقيب الكهربائي. تم استخدام Act-Actin كعنصر تحكم في التحميل. (ج) صور مجهرية إلكترونية للإرسال للبنية التحتية الدقيقة لخلايا هيلا مع أو بدون TMV-RNA في مختلف H.P.T. مرات. لوحظت فجوات البلعمة والعضيات الحويصلية الحمضية في السيتوبلازم (رؤوس الأسهم) ، وتزايدت الفجوات مع زيادة وقت تعداء العدوى. Con ، Control ، خلايا هيلا بدون TMV-RNA ترنسفكأيشن ليبو ، خلايا هيلا المعالجة بالجسيمات الشحمية فقط. شريط النطاق: 2 ميكرومتر. (د) تم تحليل متوسط ​​عدد الفجوات لكل خلية في ما لا يقل عن 100 حقل TEM تم اختياره عشوائيًا. شريط النطاق: 1 ميكرومتر. *ص& lt0.001. (بتم إجراء النشاف الغربي لـ LC3 باستخدام محلولات من خلايا هيلا المنقولة باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة. تم استخدام Act-Actin كعنصر تحكم في التحميل. (ه) تم استخدام مقايسة تدفق LC3 المستندة إلى اللطخة المناعية عن طريق قياس التدفق الخلوي لرصد التغيرات في التدفق الذاتي بوساطة TMV-RNA. كشف تحليل LC3 في خلايا هيلا أن النسبة المئوية للخلايا ذات البلعوم الذاتي زادت بشكل ملحوظ عندما تم نقلها باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 24 أو 48 ساعة ، في حين لوحظ عدد أقل من البلعمة الذاتية في الخلايا المعالجة بـ 3-MA (البلعمة الذاتية) مثبط ، 5 مم). *ص& lt0.001. جميع النتائج من خمس تجارب مستقلة.

(أ) تعداء TMV أو TMV-RNA إلى خلايا هيلا. (أتم نقل TMV إلى خلايا هيلا عن طريق التثقيب الكهربائي بجهد 0 ، 140 ، 280 و 350. تم إجراء النشاف الغربي لـ TMV CP باستخدام محلولات من خلايا هيلا المنقولة بواسطة TMV لمدة 24 ساعة. (ب) تم نقل TMV-RNA (T-RNA) إلى خلايا هيلا باستخدام الجسيمات الشحمية بنسب 1: 1 و 1: 2 (T-RNA / Lipo) تم استخدام خلايا هيلا المعالجة بالجسيمات الشحمية فقط (ليبو) كعنصر تحكم سلبي وتلك تم استخدام TMV من النوع البري كعنصر تحكم إيجابي. تم إجراء النشاف الغربي لـ CP باستخدام lysates من خلايا TMV أو خلايا هيلا المنقولة لمدة 24 ساعة. تم الكشف عن المزيد من CP بنسب 1: 1 من 1: 2. وهكذا كان تعداء الجسيم الشحمي لـ TMV-RNA أكثر فعالية وأقل سمية لخلايا هيلا من التثقيب الكهربائي. تم استخدام Act-Actin كعنصر تحكم في التحميل. (ج) صور مجهرية إلكترونية للإرسال للبنية التحتية الدقيقة لخلايا هيلا مع أو بدون TMV-RNA في مختلف H.P.T. مرات. لوحظت فجوات البلعمة والعضيات الحويصلية الحمضية في السيتوبلازم (رؤوس الأسهم) ، وتزايدت الفجوات مع زيادة وقت تعداء العدوى. Con ، Control ، خلايا هيلا بدون TMV-RNA ترنسفكأيشن ليبو ، خلايا هيلا المعالجة بالجسيمات الشحمية فقط. شريط النطاق: 2 ميكرومتر. (د) تم تحليل متوسط ​​عدد الفجوات لكل خلية في ما لا يقل عن 100 حقل TEM تم اختياره عشوائيًا. شريط النطاق: 1 ميكرومتر. *ص& lt0.001. (بتم إجراء النشاف الغربي لـ LC3 باستخدام محلولات من خلايا هيلا المنقولة باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة. تم استخدام Act-Actin كعنصر تحكم في التحميل. (ه) تم استخدام مقايسة تدفق LC3 المستندة إلى اللطخة المناعية عن طريق قياس التدفق الخلوي لمراقبة التغيرات في تدفق البلعمة الذاتي بوساطة TMV-RNA. كشف تحليل LC3 في خلايا هيلا أن النسبة المئوية للخلايا ذات البلعوم الذاتي زادت بشكل ملحوظ عندما تم نقلها باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 24 أو 48 ساعة ، في حين لوحظ عدد أقل من البلعمة الذاتية في الخلايا المعالجة بـ 3-MA (البلعمة الذاتية) مثبط ، 5 مم). *ص& lt0.001. جميع النتائج من خمس تجارب مستقلة.

يسبب TMV-RNA الالتهام الذاتي في خلايا هيلا

بعد أن أنشأنا نظام تعداء موثوقًا به ، قمنا بمراقبة التغيرات المورفولوجية في خلايا هيلا بعد تعداء TMV-RNA عن طريق الفحص المجهري الضوئي. في 24 ساعة بعد تعداء العدوى ، وجدنا أن بعض الفجوات قد تم إنتاجها في السيتوبلازم لخلايا هيلا. بعد 72 ساعة ، كانت نسبة الفجوات أكثر من 50٪ لكل مجال رؤية مجهري. لتحديد ما إذا كان الالتهام الذاتي قد تم تشغيله بعد ترنسفكأيشن ، تم تحليل البنية التحتية لخلايا هيلا المنقولة بواسطة TMV-RNA لمدة 6 و 24 و 48 و 72 ساعة بواسطة TEM.لوحظت العديد من الفجوات وبعض الفجوات المرتبطة بالغشاء والتي تتميز بها البلعوم الذاتي (رؤوس الأسهم) في السيتوبلازم للخلايا المنقولة (الشكل 1C ، T-6 h ، T-24 h). علاوة على ذلك ، زادت البلعمة الذاتية الناضجة النموذجية ذات الهياكل الفراغية ذات الغشاء المزدوج التي تحتوي على محتويات حشوية مرئية بمرور الوقت (الشكل 1C ، T-48 h ، T-72 h الشكل 1D). نادراً ما توجد فجوات في الخلايا غير المنقولة بواسطة TMV-RNA (الشكل 1C ، Con) ، ولم يلاحظ سوى عدد قليل من الفجوات في الخلايا المحتضنة مع الجسيمات الشحمية فقط (الشكل 1C ، Lipo). تشير النتيجة الأخيرة إلى أن كمية الجسيمات الشحمية المعطاة كانت أقل سمية للخلايا.

كما هو موضح أعلاه ، يتم استخدام LC3 كعلامة محددة لمقصورة البلعمة الذاتية ، ويؤدي تحريض الالتهام الذاتي إلى معالجة LC3-I في LC3-II. لاكتشاف تحويل LC3-I إلى LC3-II ، تم تحليل الخلايا المنقولة باستخدام TMV-RNA لمدة 24 و 48 و 72 ساعة بواسطة النشاف الغربي. وجدنا أنه تم زيادة تحويل LC3-I إلى LC3-II إذا تم تمديد علاج TMV-RNA إلى 72 ساعة (الشكل 1 ب). لرصد التعديلات في التدفق الذاتي بوساطة TMV-RNA ، تم إجراء اختبار LC3 القائم على اللطخة المناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد عدد البلعمة الذاتية. كما هو مبين في الشكل 1 (E) ، تمت زيادة الخلايا ذات البلعوم الذاتي التي تم اكتشافها باستخدام جسم مضاد لـ LC3 مترافق مع FITC في خلايا هيلا بعد تعداء TMV-RNA ، بينما كان التعبير عن LC3-II غير قابل للكشف تقريبًا في الخلايا غير المنقولة. علاوة على ذلك ، تم استخدام 3-MA ، وهو مثبط شائع للالتهام الذاتي [29] ، لمنع الالتهام الذاتي في خلايا هيلا. في الخلايا المنقولة بواسطة TMV-RNA التي عولجت بـ 3-MA (5 ملي مولار ، سيجما) لمدة 24 ساعة ، تم تثبيط الالتهام الذاتي بشكل ملحوظ. إجمالاً ، تشير هذه الملاحظات إلى أن TMV-RNA تحفز الالتهام الذاتي في خلايا هيلا.

TMV-RNA هو العامل الرئيسي لتحفيز الالتهام الذاتي في خلايا هيلا

يعد تنشيط جينات الالتهام الذاتي خطوة حاسمة في تكوين البلعمة الذاتية [17]. لفحص ما إذا كان جين الالتهام الذاتي الرئيسي (Beclin1) [21] قد تم تنشيطه بشكل تآزري أثناء الالتهام الذاتي الناجم عن TMV-RNA ، تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي والنشاف الغربي لمراقبة مستويات الحمض النووي والبروتين ، على التوالي ، من Beclin1.

زاد Beclin1 مرنا بشكل ملحوظ عندما تم تمديد وقت تعداء إلى 72 ساعة (الشكل 2A). في الوقت نفسه ، تراكم بروتين Beclin1 بشكل ملحوظ خلال 24 ساعة في خلايا هيلا المعالجة بـ TMV-RNA ، وكان تراكم البروتين أكثر وضوحًا عندما تم تمديد وقت تعداء العدوى إلى 72 ساعة (الشكل 2 ب). لم يتم العثور على الحمض النووي Beclin1 ولا بروتين Beclin1 في خلايا هيلا غير المصابة بـ TMV-RNA. للتحقق من أن تنشيط Beclin1 في خلايا هيلا كان مرتبطًا بالفعل بالالتهام الذاتي الناجم عن TMV-RNA ، تم نقل خط خلايا سرطان الثدي البشري حيث يتم حذف Beclin1 بشكل أحادي وبالتالي يتم التعبير عنه بمستويات منخفضة (خلايا MCF7) [30] مع TMV-RNA باستخدام نفس البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، للتدخل في التعبير عن جين Beclin1 في الخلايا ، قمنا أيضًا بنقل ناقل Beclin1 siRNA (ناقل الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل) إلى خلايا هيلا. تم نقل ناقل Beclin1 siRNA إلى خلايا هيلا 24 ساعة قبل تعداء TMV-RNA. أظهر تحليل التعبير عن Beclin1 و LC3 في خلايا MCF7 أو خلايا هيلا بواسطة النشاف الغربي أنه لم يتم اكتشاف Beclin1 في خلايا MCF7 مع أو بدون ترنسفكأيشن TMV-RNA ، ولم يتغير مستوى التعبير عن LC3 في خلايا MCF7 بعد تعداء (الشكل الشكل). 2 ج). علاوة على ذلك ، تم تقليل التعبير عن كل من LC3 و Beclin1 في خلايا هيلا المنقولة مع كل من ناقل Beclin1 siRNA و TMV-RNA مقارنة بالخلايا المنقولة باستخدام TMV-RNA فقط (الشكلان 2 ب و 2 ج). مجتمعة ، يؤدي غزو TMV-RNA مباشرة إلى الالتهام الذاتي ، و Beclin1 هو الجين الرئيسي في البلعمة الذاتية في خلايا هيلا TMV-RNA المنقولة.

TMV-RNA هو العامل الرئيسي الذي ينشط Beclin1 في خلايا هيلا

(أ) تحليل PCR في الوقت الحقيقي لـ Beclin1 mRNA من خلايا هيلا المنقولة باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 6 أو 24 أو 48 أو 72 ساعة. زاد Beclin1 مرنا بشكل ملحوظ. *ص& lt0.001. (ب) تحليل اللطخة الغربية لـ Beclin1 باستخدام lysates من خلايا هيلا المنقولة باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة. تم تنشيط Beclin1 وزيادته مع تمديد وقت تعداء الجسم. (ج) تحليل اللطخة الغربية لـ Beclin1 و LC3 باستخدام lysates من خلايا هيلا المنقولة بواسطة TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة في وجود ناقل Beclin1 siRNA. تم أيضًا نقل خلايا MCF7 باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 24 ساعة. لم يختلف تعبير Beclin1 ولا تحويل LC3-I إلى LC3-II اختلافًا كبيرًا بين خلايا MCF7 وخلايا هيلا. تم استخدام Act-Actin كعنصر تحكم في التحميل.

(أ) تحليل PCR في الوقت الحقيقي لـ Beclin1 mRNA من خلايا هيلا المنقولة باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 6 أو 24 أو 48 أو 72 ساعة. زاد Beclin1 مرنا بشكل ملحوظ. *ص& lt0.001. (ب) تحليل اللطخة الغربية لـ Beclin1 باستخدام lysates من خلايا هيلا المنقولة باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة. تم تنشيط Beclin1 وزيادته مع تمديد وقت تعداء الجسم. (ج) تحليل اللطخة الغربية لـ Beclin1 و LC3 باستخدام lysates من خلايا هيلا المنقولة بواسطة TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة في وجود ناقل Beclin1 siRNA. تم أيضًا نقل خلايا MCF7 باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 24 ساعة. لم يختلف تعبير Beclin1 ولا تحويل LC3-I إلى LC3-II اختلافًا كبيرًا بين خلايا MCF7 وخلايا هيلا. تم استخدام Act-Actin كعنصر تحكم في التحميل.

للحصول على مزيد من الأدلة المورفولوجية المباشرة للروابط بين بروتينات TMV والفجوات الذاتية داخل الخلايا ، تم إجراء الفحص المجهري المناعي. يتم عرض جزيئات العصب المناعي التي تحدد بروتينات TMV في الغالب على أغشية البلعوم الذاتي لمدة 24 ساعة بعد تعداء العدوى (الشكل 3 أ-ب) عندما تم تمديد الوقت إلى 48 ساعة ، تراكمت جزيئات العصب المناعي بشكل ملحوظ على أغشية البلعمة الذاتية أو حولها (الشكل 3 أ-ج). لم يتم العثور على جزيئات المناعة ولا autophagosomes في الخلايا غير المنقولة (الشكل 3 أ-أ).

صورة مجهرية إلكترونية تظهر بروتين TMV على أغشية البلعمة الذاتية وحولها

(أ) الفحص المجهري الإلكتروني المناعي لخلايا هيلا المنقولة بواسطة برنامج تلفزيوني (يخدع ، أ) أو TMV-RNA لمدة 24 (T-24 ساعة ، ب) أو 48 ساعة (T-48 ساعة ، ج). (ب) كانت جزيئات TP (بروتين TMV) موجودة في الغالب على أغشية البلعمة الذاتية (أ، البلعمة الذاتية). (ج) جزيئات TP المناعية (TP ، رؤوس الأسهم) المتراكمة على وحول أغشية البلعمة الذاتية (أ، البلعمة الذاتية). أشرطة المقياس: 0.5 ميكرومتر ، 100 نانومتر (كما هو موضح في التوسيعات). (ب) البنية التحتية لخلايا هيلا بواسطة EM. فيريونات TMV المشتبه بها (ب، T ، رؤوس سهام) ، التي يشبه هيكلها فيريونات TMV في أوراق التبغ (أ، التبغ ، تي) ، مصطفة في شكل متوازي وتتراكم حول فجوات عصارية خلوية. أشرطة مقياس: 1 ميكرومتر ، 200 نانومتر (كما هو موضح في التوسيع).

(أ) الفحص المجهري الإلكتروني المناعي لخلايا هيلا المنقولة بواسطة برنامج تلفزيوني (يخدع ، أ) أو TMV-RNA لمدة 24 (T-24 ساعة ، ب) أو 48 ساعة (T-48 ساعة ، ج). (ب) كانت جزيئات TP (بروتين TMV) موجودة في الغالب على أغشية البلعمة الذاتية (أ، البلعمة الذاتية). (ج) جزيئات TP المناعية (TP ، رؤوس الأسهم) المتراكمة على وحول أغشية البلعمة الذاتية (أ، البلعمة الذاتية). أشرطة المقياس: 0.5 ميكرومتر ، 100 نانومتر (كما هو موضح في التوسيعات). (ب) البنية التحتية لخلايا هيلا بواسطة EM. فيريونات TMV المشتبه بها (ب، T ، رؤوس سهام) ، التي يشبه هيكلها فيريونات TMV في أوراق التبغ (أ، التبغ ، تي) ، مصطفة في شكل متوازي وتتراكم حول فجوات عصارية خلوية. أشرطة المقياس: 1 ميكرومتر ، 200 نانومتر (كما هو موضح في التوسيعات).

كأول دراسة للتحقيق في غزو TMV في الخلايا البشرية ، كنا نأمل في العثور على جزيئات TMV السليمة في خلايا هيلا إذا كان لدى TMV القدرة على الهروب من الدفاع المناعي وتجنب هضمه بواسطة الليزوزوم. في الواقع ، لاحظنا فيروسات TMV المشتبه بها في خلايا هيلا بواسطة TEM. كما هو مبين في الشكل 3 (ب-ب) ، فإن فيروسات TMV المشتبه بها تصطف في شكل مواز وتتراكم حول فجوات. تشبه الفيروسات حزمًا من الخيوط المطعمة في السيتوبلازم الخلوي. كانت السمات المرصودة مشابهة لفيريونات TMV التي لوحظت في أوراق التبغ [31] (الشكل 3 ب-أ) ، لذلك استنتجنا أن TMV-RNA قد يتكاثر في خلايا هيلا.

الآلية المحتملة للالتهام الذاتي الناجم عن TMV-RNA في خلايا هيلا

بناءً على الملاحظات المدهشة أعلاه ، أجرينا مزيدًا من التجارب لدعم فرضيتنا. كما ذكر أعلاه ، فإن التركيب الجيني لـ TMV-RNA يعمل مثل بنية الرنا المرسال حيث يمكن ترجمته إلى بروتينات مباشرة. يمكن أن تستخدم TMV المضيف ER باعتباره الموقع الأساسي للتكوين الحيوي للبروتين السكري للمغلف ، والتكاثر الجيني وتجميع الجسيمات. إذا حدثت ترجمة TMV-RNA في ER ، فإن تراكم بروتين TMV سيؤدي حتمًا إلى استجابات الإجهاد الخلوي ، مثل ERS ، والتي قد تعزز الالتهام الذاتي في خلايا هيلا. لاختبار هذا الافتراض ، تم اتباع ثلاث طرق.

يتم ترجمة TMV-RNA في غشاء ER لخلايا هيلا

في الخلايا حقيقية النواة ، يتم تقسيم الرنا المرسال بين مقصورات العصارة الخلوية و ER. كما هو موضح في النماذج الحالية ، فإن عملية تقسيم mRNA في كل مكان مدفوعة بدورة ترجمة مشتركة لربط الريبوسوم وإطلاقه في ER. باختصار ، يتم ترجمة جميع الرنا المرسال في العصارة الخلوية. في وقت مبكر من التوليف ، يتم نقل تلك mRNA / RNCs (معقدات سلسلة الريبوسوم / الوليدة متعددة الببتيد) المنخرطة في تخليق البروتينات الإفرازية / الغشائية إلى ER بسبب وجود SRP (جسيم التعرف على الإشارة) [32]. لذلك سعينا إلى تحديد ما إذا كان TMV-RNA مدفوعًا بدورة ترجمة مشتركة لربط الريبوسوم وترجمة البروتينات في ER وتأكيد موقع TMV-RNA.

بعد تعداء TMV-RNA لمدة 24 و 48 و 72 ساعة ، تم حصاد محلولات الخلايا واستخدامها للكشف عن البروتينات عن طريق النشاف الغربي. تشير النتائج إلى أن TMV-RNA تمت ترجمته إلى CP CP زاد بشكل ملحوظ خلال 24 ساعة في خلايا هيلا المعالجة بـ TMV-RNA ، وزاد تراكم البروتين بشكل أكبر عندما تم تمديد وقت انتقال العدوى إلى 72 ساعة ، بينما كان غير قابل للكشف في هيلا. الخلايا غير المنقولة مع TMV-RNA (الشكل 4A). بالنظر إلى المستوى العالي للتعبير عن CP في خلايا هيلا ، استنتجنا أن TMV قد تفلت من الدفاع المناعي. لتحديد ما إذا كان TMV-RNA قد تمت ترجمته في ER ، قمنا بعزل ER من خلايا هيلا المنقولة بواسطة TMV-RNA لمدة 24 و 48 و 72 ساعة. أظهر تحليل CP في جزء ER بواسطة النشاف الغربي أن مستوى التعبير عن CP زاد بشكل ملحوظ عندما تم تمديد الوقت إلى 72 ساعة (الشكل 4 أ). لتأكيد ما إذا كان CP يقع في ER ولمراقبة موقع TMV-RNA ، أجرينا تقنيات التألق المناعي (IF) و FISH [25] على التوالي. تم تحديد الحمض النووي الريبي إيجابي TMV والبروتينات فى الموقع عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر في الخلايا المثبتة بواسطة بروتوكول يهدف إلى الاحتفاظ بحجم الخلية الأصلية وشكلها. تم تصوير الحمض النووي الريبي الموجب لـ TMV بواسطة FISH باستخدام مسبار خاص بالحبلا تم تمييزه باستخدام اللون الفلوري Cy3 (أحمر). تم اكتشاف CP باستخدام جسم مضاد مضاد لـ CP للأرنب وجسم مضاد ثانوي مقابل (جسم مضاد للأرنب Alexa Fluor® 488) (أخضر) ، وتم تلوين ER باستخدام متعقب ER (أزرق ، Invitrogen). كما هو مبين في الشكل 4 (ب) ، أشار التألق الأزرق والأحمر والأخضر إلى مواقع ER و RNA إيجابي TMV و CP ، على التوالي ، في خلايا هيلا المنقولة بواسطة TMV-RNA لمدة 48 ساعة [H.P.T. (ساعات بعد تعداء) 48 ساعة]. لاحظنا أن CP (الأخضر) تراكم بالفعل في ER كحبيبات صغيرة غير منتظمة الحجم ، في حين نادراً ما ظهر TMV-RNA (الأحمر) في ER ولكنه تم إثرائه في النواة. لم يتم العثور على CP ولا الحمض النووي الريبي إيجابي TMV في الخلايا غير المنقولة باستخدام TMV-RNA (الشكل 4C-c).

يتم ترجمة TMV-RNA إلى CP ويزيد من ER لخلايا هيلا

(أ) لطخة غربية من CP باستخدام lysates من خلايا هيلا [المنقولة باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة] أو جزء ER من خلايا هيلا (المنقولة باستخدام TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة) . تمت ترجمة TMV-RNA إلى CP في خلايا هيلا وتراكمت في ER حيث تم تمديد وقت تعداء الخلايا إلى 72 ساعة. (ب) الجمع بين IF و RNA-FISH للكشف عن CP و TMV-RNA الإيجابي. تم نقل خلايا هيلا باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 48 ساعة. تم إصلاح الخلايا ونفاذها للكشف عن CP باستخدام جسم مضاد مضاد لـ CP في الأرانب وجسم مضاد ثانوي مطابق (جسم مضاد للأرنب Alexa Fluor® 488) (أخضر). ثم عولجت نفس الخلايا لتحليل FISH. تم تهجين الخلايا بمسبار مُسمى بـ فلوروكروم Cy3 (أحمر) لاكتشاف الحمض النووي الريبي إيجابي TMV (قبل الميلاد، T-RNA). تم تلطيخ جهاز تعقب ER (أزرق ، ب- د ج-ب، ER). ثم تمت ملاحظة الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. (أ) خلايا هيلا (ب ، ج) ، DIC (تباين التداخل التفاضلي) CP (أخضر ، ب- ب) ظلت إلى حد كبير في ER (يكون: اندمجت ب و د) TMV إيجابي الحمض النووي الريبي (أحمر ، قبل الميلاد، T-RNA ،) نادرًا ما كان موجودًا في ER (ب-و: اندمجت ج و د) لكنها ظهرت في النواة. (ج) لم يتم العثور على CP ولا RNA إيجابي TMV في الخلايا المنقولة باستخدام PBS (نسخة) (شريط النطاق: 10 ميكرومتر).

(أ) لطخة غربية من CP باستخدام lysates من خلايا هيلا [المنقولة باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة] أو جزء ER من خلايا هيلا (المنقولة باستخدام TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة) . تمت ترجمة TMV-RNA إلى CP في خلايا هيلا وتراكمت في ER حيث تم تمديد وقت تعداء الخلايا إلى 72 ساعة. (ب) الجمع بين IF و RNA-FISH للكشف عن CP و TMV-RNA الإيجابي. تم نقل خلايا هيلا باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 48 ساعة. تم إصلاح الخلايا ونفاذها للكشف عن CP باستخدام الجسم المضاد للأرنب المضاد لـ CP والجسم المضاد الثانوي المقابل (الجسم المضاد للأرنب Alexa Fluor® 488) (الأخضر). ثم عولجت نفس الخلايا لتحليل FISH. تم تهجين الخلايا بمسبار مُسمى بـ فلوروكروم Cy3 (أحمر) لاكتشاف الحمض النووي الريبي إيجابي TMV (قبل الميلاد، T-RNA). تم تلطيخ جهاز تعقب ER (أزرق ، ب- د ج-ب، ER). ثم تمت ملاحظة الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. (أ) خلايا هيلا (ب ، ج) ، DIC (تباين التداخل التفاضلي) CP (أخضر ، ب- ب) ظلت إلى حد كبير في ER (يكون: اندمجت ب و د) TMV إيجابي الحمض النووي الريبي (أحمر ، قبل الميلاد، T-RNA ،) نادرًا ما كان موجودًا في ER (ب-و: اندمجت ج و د) لكنها ظهرت في النواة. (ج) لم يتم العثور على CP ولا RNA إيجابي TMV في الخلايا المنقولة باستخدام PBS (نسخة) (شريط النطاق: 10 ميكرومتر).

استخدمنا بعد ذلك مسبارًا غير ذي صلة كعنصر تحكم سلبي للتحقق من موقع الحمض النووي الريبي إيجابي TMV. تم إصلاح الخلايا المنقولة باستخدام TMV-RNA لمدة 24 و 48 ساعة وتحليلها باستخدام تقنيات IF و RNA-FISH نفسها ، وكان الاختلاف الوحيد هو أنه بدلاً من خطوة تلطيخ ER ، كانت نواة الخلية ملطخة بـ DAPI (أزرق ، Invitrogen). وهكذا يمثل التألق الأزرق موقع النواة في الشكل 5. عندما قمنا بمراقبة الخلايا بعد تعداء TMV-RNA لمدة 24 ساعة ، تم العثور على الحمض النووي الريبي إيجابي TMV (الأحمر) في جميع الخلايا على شكل حبيبات صغيرة غير منتظمة الحجم (الشكل 5 ب ، HPT 24 ساعة) التي تراكمت بعد ذلك في النواة كحبيبات عالية الكثافة بعد 48 ساعة (الشكل 5C ، HPT 48 ساعة). بالإضافة إلى ذلك ، كان CP (الأخضر) موجودًا حول النواة وتراكم في السيتوبلازم خلال 48 ساعة. في المقابل ، لا يمكن اكتشاف الحمض النووي الريبي إيجابي TMV في الخلايا المنقولة باستخدام TMV-RNA التي تم تهجينها باستخدام مسبار غير ذي صلة (الشكل 5A-c ، Con). تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى أن TMV-RNA يستخدم الريبوسومات داخل الخلايا لتخليق البروتينات الفيروسية في ER وأن الحمض النووي الريبي الإيجابي يتمركز في النواة لأداء وظائف أخرى. قد تفسر هذه النتيجة نتيجتنا السابقة (الشكل 3 ب-ب) التي أظهرت وجود فيروسات TMV المشتبه بها في خلايا هيلا.

تراكم الحمض النووي الريبي إيجابي TMV في نواة خلية هيلا

تم الجمع بين IF و RNA-FISH للتحقق من موقع RNA الإيجابي لـ TMV. تم نقل خلايا هيلا باستخدام TMV-RNA لمدة 24 (أ, ب، H.P.T. 24 ساعة) أو 48 ساعة بعد تعداء العدوى (ج، H.P.T. 48 ح) ، ثم يتم تثبيتها وتهجينها باستخدام مسبار غير ذي صلة (أ، Con) أو مسبار خاص بحبلا (ب, ج). باستثناء الفلورة الزرقاء التي تشير إلى النواة (ملطخة بـ DAPI ، أ-ب ، ب- د ، ج- د، أزرق) بدلاً من ER (الشكل 4) ، كانت البقع الأخرى هي نفسها كما في الشكل 4 (أ) ، (أ-ج) ، خلايا هيلا ، مدينة دبي للإنترنت (تباين التداخل التفاضلي) CP (ب ب ، ج ب، أخضر) تم العثور عليه باستمرار في السيتوبلازم خلال 48 ساعة (ب-ه ، ج-ه، مدمجة ب و د). في 24 H.P.T. ، الحمض النووي الريبي إيجابي TMV (قبل الميلاد، T-RNA ، أحمر) في جميع أنحاء الخلية ، وتراكم بشكل كبير حول النواة (ب-و، مدمجة ج و د). مع إطالة الوقت إلى 48 ساعة ، كان الحمض النووي الريبي إيجابي TMV (نسخة، T-RNA ، أحمر) المتراكمة في نواة خلية هيلا (سي-و، مدمجة ج و د). تشير هذه النتيجة إلى أن الحمض النووي الريبي إيجابي TMV قد تم نقله تدريجيًا من السيتوبلازم إلى النواة (يتراكم بشكل خاص في النواة) ، في حين أنه لم يتم العثور عليه في الخلايا المنقولة باستخدام TMV-RNA ولكن بدلاً من ذلك تم تهجينه باستخدام مسبار غير ذي صلة مُسمى بـ Cy3 fluorochrome (أ-ج) (شريط النطاق: 10 ميكرومتر).

تم الجمع بين IF و RNA-FISH للتحقق من موقع RNA الإيجابي لـ TMV. تم نقل خلايا هيلا باستخدام TMV-RNA لمدة 24 (أ, ب، H.P.T. 24 ساعة) أو 48 ساعة بعد تعداء العدوى (ج، H.P.T. 48 ح) ، ثم يتم تثبيتها وتهجينها باستخدام مسبار غير ذي صلة (أ، Con) أو مسبار خاص بحبلا (ب, ج). باستثناء الفلورة الزرقاء التي تشير إلى النواة (ملطخة بـ DAPI ، أ-ب ، ب- د ، ج- د، أزرق) بدلاً من ER (الشكل 4) ، كانت البقع الأخرى هي نفسها كما في الشكل 4 (أ) ، (أ-ج) ، خلايا هيلا ، مدينة دبي للإنترنت (تباين التداخل التفاضلي) CP (ب ب ، ج ب، أخضر) تم العثور عليه باستمرار في السيتوبلازم خلال 48 ساعة (ب-ه ، ج-ه، مدمجة ب و د). في 24 H.P.T. ، RNA إيجابي TMV (قبل الميلاد، T-RNA ، أحمر) في جميع أنحاء الخلية ، وتراكم بشكل كبير حول النواة (ب-و، مدمجة ج و د). مع إطالة الوقت إلى 48 ساعة ، كان الحمض النووي الريبي إيجابي TMV (نسخة، T-RNA ، أحمر) المتراكمة في نواة خلية هيلا (سي-و، مدمجة ج و د). تشير هذه النتيجة إلى أن الحمض النووي الريبي إيجابي TMV قد تم نقله تدريجيًا من السيتوبلازم إلى النواة (يتراكم بشكل خاص في النواة) ، في حين أنه لم يتم العثور عليه في الخلايا المنقولة باستخدام TMV-RNA ولكن بدلاً من ذلك تم تهجينه باستخدام مسبار غير ذي صلة مُسمى بـ Cy3 fluorochrome (أ-ج) (شريط النطاق: 10 ميكرومتر).

TMV-RNA المستحثة ERS

الهدف الأولي لاستجابة ERS هو حماية الخلايا المجهدة عن طريق إعادة تكوين التوازن أو تحييد العواقب الضارة للإهانة. هنا ، وجدنا أن TMV-RNA عزز تراكم CP في ER. لذلك افترضنا أن تراكم هذا البروتين يسبب ERS في خلايا هيلا.

لاختبار هذه الفرضية ، قمنا بتقييم التعبير عن GRP78 ، وهو علامة لـ ERS ، في كل من كسور الخلية الكاملة و ER.تشير نتائج النشاف الغربي إلى أنه في غضون 24 ساعة ، تراكم GRP78 في كل من الخلية الكاملة وأجزاء ER ، وزاد مستواه بشكل ملحوظ عندما تم تمديد وقت تعداء العدوى إلى 72 ساعة. في المقابل ، لم يلاحظ أي تراكم لـ GRP78 في خلايا هيلا غير المنقولة باستخدام TMV-RNA (الشكل 6 أ). تشير هذه البيانات إلى أن TMV-RNA يحفز ERS على تراكم بروتين TMV في ER يستحث ERS وينشط GRP78 للارتباط بالبروتينات غير المطوية (مثل CP) ، وبالتالي زيادة قدرتها على الطي. بمجرد أن تتجاوز وفرة هذه البروتينات غير المطوية قدرة GRP78 ، سيثير ERS سلسلة من الأحداث ، مثل الالتهام الذاتي ، لاستعادة وظيفة الخلية الطبيعية.

يتم تنشيط GRP78 ، وهو علامة من ERS ، ويتراكم في ER ، وتظهر الصور المجهرية الإلكترونية أن تكوين autophagosomes يرتبط بتوسع غشاء ER

(أ) النشاف الغربي لـ GRP78 باستخدام lysates من خلايا هيلا [المنقولة باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة] أو جزء ER من خلايا هيلا (المنقولة باستخدام TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة) أشار إلى أن GRP78 تم التعبير عنه بشكل كبير في خلايا هيلا وتراكم بشكل رئيسي في ER عندما تم تمديد وقت تعداء الخلايا إلى 72 ساعة. تم استخدام Act-Actin كعنصر تحكم في التحميل. (H.P.T. ، ساعات بعد تعداء). (ب) صور مجهرية إلكترونية تمثيلية للإرسال تصور البنية التحتية الدقيقة لخلايا هيلا المنقولة مع أي من برنامج تلفزيوني (أ، Con) أو TMV-RNA لمدة 48 ساعة. كشف تحليل هذه الصور المجهرية أن معظم أغشية ER في الخلايا المصابة بالنقل TMV-RNA كانت في حالة تمدد ، وظهرت العديد من الفجوات ، بما في ذلك الفجوات الوليدة والأوتوفوسومات النموذجية ذات الهياكل الفراغية ثنائية الغشاء التي تحتوي على محتويات حشوية مرئية ، حول التمدد. ER. تمدد الطرف البعيد من غشاء ER لتشبه الأصابع أو الشوك المتورمة ، والذي نادرًا ما لوحظ في عناصر التحكم (أ). كما هو موضح في الصور ، تمدد الطرف البعيد من غشاء ER باتجاه الفجوة الأمامية (ب، مربع) ربما يكون غشاء ER الذي تمدد لتشبه الأصابع المتورمة قد عزل فجوة (ج، صندوق ، رؤوس سهام) تمدد طرف غشاء ER بعيد آخر باتجاه الفجوة الأمامية ويبدو أنه يغلفها (د، علبة). عزل الطرف الآخر البعيد من غشاء ER الموسع فجوة (د، ورؤوس الأسهم) ، وتم توسيع غشاء ER بشكل كبير لدرجة أنه قد ينتج المزيد من الفجوات (ه، رؤوس سهام). فجوات ناشئة تنبثق من نقطة نهاية أغشية ER الموسعة (F، ومربع ، ورؤوس سهام) وأحداث الاندماج بين الجسيمات الحالة والفجوات الذاتية (F، علبة). أخيرًا ، تم تكوين جسيم ذاتي ضخم في السيتوبلازم ، وتم توسيع أغشية ER الجزئية لتشبه الشوك (ز، صندوقين صغيرين) ، وتم عزل فجوة واحدة للتو من أغشية ER الجزئية الأخرى (ز، رؤوس سهام) (شريط مقياس: 2 ميكرومتر). من هذه الصور المجهرية ، نفترض أن ERS حفز توسع ER ، مما أدى إلى تكوين autophagosomes.

(أ) النشاف الغربي لـ GRP78 باستخدام lysates من خلايا هيلا [المنقولة باستخدام PBS (Con) أو TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة] أو جزء ER من خلايا هيلا (المنقولة باستخدام TMV-RNA لمدة 24 أو 48 أو 72 ساعة) أشار إلى أن GRP78 تم التعبير عنه بشكل كبير في خلايا هيلا وتراكم بشكل رئيسي في ER عندما تم تمديد وقت تعداء الخلايا إلى 72 ساعة. تم استخدام Act-Actin كعنصر تحكم في التحميل. (H.P.T. ، ساعات بعد تعداء). (ب) صور مجهرية إلكترونية تمثيلية للإرسال تصور البنية التحتية الدقيقة لخلايا هيلا المنقولة مع أي من برنامج تلفزيوني (أ، Con) أو TMV-RNA لمدة 48 ساعة. كشف تحليل هذه الصور المجهرية أن معظم أغشية ER في الخلايا المصابة بالنقل TMV-RNA كانت في حالة تمدد ، وظهرت العديد من الفجوات ، بما في ذلك الفجوات الوليدة والأوتوفوسومات النموذجية ذات الهياكل الفراغية ثنائية الغشاء التي تحتوي على محتويات حشوية مرئية ، حول التمدد. ER. تمدد الطرف البعيد من غشاء ER لتشبه الأصابع أو الشوك المتورمة ، والذي نادرًا ما لوحظ في عناصر التحكم (أ). كما هو موضح في الصور ، تمدد الطرف البعيد من غشاء ER باتجاه الفجوة الأمامية (ب، مربع) ربما يكون غشاء ER الذي تمدد لتشبه الأصابع المتورمة قد عزل فجوة (ج، صندوق ، رؤوس سهام) تمدد طرف غشاء ER بعيد آخر باتجاه الفجوة الأمامية ويبدو أنه يغلفها (د، علبة). عزل الطرف الآخر البعيد من غشاء ER الموسع فجوة (د، ورؤوس الأسهم) ، وتم توسيع غشاء ER بشكل كبير لدرجة أنه قد ينتج المزيد من الفجوات (ه، رؤوس سهام). فجوات ناشئة تنبثق من نقطة نهاية أغشية ER الموسعة (F، ومربع ، ورؤوس سهام) وأحداث الاندماج بين الجسيمات الحالة والفجوات الذاتية (F، علبة). أخيرًا ، تم تكوين جسيم ذاتي ضخم في السيتوبلازم ، وتم توسيع أغشية ER الجزئية لتشبه الشوك (ز، صندوقين صغيرين) ، وتم عزل فجوة واحدة للتو من أغشية ER الجزئية الأخرى (ز، رؤوس سهام) (شريط مقياس: 2 ميكرومتر). من هذه الصور المجهرية ، نفترض أن ERS حفز توسع ER ، مما أدى إلى تكوين autophagosomes.

ERS هو المحفز المحتمل للالتهام الذاتي

بدأ التعرف على الالتهام الذاتي كلاعب مهم في قرارات الحياة والموت لاستجابة ERS. إن آليات التحكم في هذه العمليات ليست مفهومة تمامًا وهي محور العديد من التحقيقات الجارية. أظهرت العديد من التقارير أن ERS يمكن أن ينشط الالتهام الذاتي ، وعلى العكس من ذلك ، فإن منع الالتهام الذاتي يمكن أن يعزز موت الخلايا الناجم عن ERS [33]. في دراسات المجهر الإلكتروني المناعي الحديثة ، أفاد دن أن autophagosomes الناشئة من ER الموجودة مسبقًا تكتسب علامات الجسيمات الليزوزومية بطريقة تدريجية أثناء النضج إلى الجسيمات الذاتية. صنف دان أيضًا الفجوات المورفولوجية والكيميائية الخلوية إلى مجموعتين: (1) فجوات البلعمة الوليدة (أو البلعوم الذاتي) و (2) الفجوات الذاتية المتدهورة (أو الجسيمات الذاتية) [34 ، 35]. هنا ، أظهرنا أن غزو TMV-RNA لم يتسبب فقط في الالتهام الذاتي ، بل تسبب أيضًا في حدوث ERS في خلايا هيلا. لتوضيح العلاقة بين الالتهام الذاتي و ERS ، قمنا بفحص التغيرات المورفولوجية للخلايا باستخدام EM.

في البداية ، اقترح تحليل EM أن غشاء البلعمة الذاتية قد ينشأ من غشاء ER على مستوى البنية التحتية. كما هو مبين في الشكل 6 (ب) ، كانت معظم أغشية ER في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل TMV-RNA في حالة تمدد ، والعديد من الفجوات ، بما في ذلك الفجوات الوليدة والأوتوفوموميس النموذجية مع هيكل فجوي مزدوج الغشاء يحتوي على محتويات حشوية مرئية ، ظهر حول ER الموسعة. يبدو أن الفجوات الوليدة قد نتجت من نهايات أغشية ER (رؤوس الأسهم) ، وتمددت لتشبه الأصابع المتورمة في بعض الصور. يمكن نقل هذه الهياكل لتشكيل البلعمة الذاتية. أظهرت بعض الصور أيضًا أن غشاء ER تمدد ليشبه الشوكات الممتدة نحو الفجوة الأمامية (الأشكال 6B-b و 6 B-d و 6 B-g) ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام أغشية ER الجزئية لتشكيل حوامل phagophores ، الهياكل التي سوف تندمج مع فجوة ناشئة. لم يتم العثور على فجوات أوتوفاجيك ولا توسيع ER في الخلايا غير المنقولة بواسطة TMV-RNA (الشكل 6 ب-أ). مجتمعة ، هناك سلسلة من الأحداث المثيرة للاهتمام التي تحدث في النهاية البعيدة من غشاء ER متوسعة مثل الأصابع أو الشوك المتورمة ، مما قد يشير إلى أن الخلايا تم تحفيزها بواسطة TMV-RNA وتحفيزها في حالة ERS. لم يتم العثور على ظاهرة توسع الغشاء ER في الخلايا غير المنقولة باستخدام TMV-RNA (الشكل 6 ب-أ).

كما هو مبين ، قد يكون غشاء ER الذي يشبه الأصابع المتورمة قد أنتج للتو فجوة (الشكل 6B-c ، رؤوس الأسهم) تم توسيع نهاية غشاء ER البعيدة لتشبه الشوكات التي تمتد نحو الفجوة الأمامية (الشكل 6B-b ، جزء) و ER آخر بعيد توسعت نهاية الغشاء نحو الفجوة الأمامية ويبدو أنها تغلفها (الشكل 6 ب-د). علاوة على ذلك ، تم عزل الطرف البعيد الآخر من غشاء ER الموسع في فجوة (الشكل 6B-d ، رؤوس الأسهم). تمدد غشاء ER بشكل كبير لدرجة أنه ربما أنتج المزيد من الفجوات (الشكل 6B-e ، رؤوس الأسهم) ، مع ظهور فجوات ناشئة من نقاط نهاية أغشية ER الموسعة (الشكل 6B-f ، رؤوس الأسهم). علاوة على ذلك ، ربما حدثت أحداث الاندماج بين الجسيمات الحالة والفجوات الذاتية (الشكل 6B-f ، جزء). أخيرًا ، تم تشكيل جسيم ذاتي ضخم في السيتوبلازم ، وتم توسيع بعض أغشية ER الجزئية لتشبه الشوكات الممتدة نحو الفجوة (الشكل 6B-g ، لوحان صغيران) وتم إنتاج فجوة واحدة للتو من أغشية ER الجزئية الأخرى (الشكل 6B-g ، رؤوس سهام). بناءً على هذه البيانات ، يبدو أن عملية الالتهام الذاتي ، بما في ذلك نضوج وتكوين البلعمة الذاتية ، كانت مطلوبة لتوسيع غشاء ER. ومن ثم أكدت كل هذه الملاحظات أن أغشية فجوات البلعمة الذاتية المرتبطة بـ TMV-RNA قد تكون متجاورة مع أغشية ER أو تنشأ منها. تشرح هذه النتيجة سبب ظهور المزيد والمزيد من الفجوات وتراكمها حول أغشية ER الموسعة عندما تم تمديد وقت تعداء. نفترض أنه ، في ظل نظام ERS ، تتوسع النهاية البعيدة لغشاء ER لتعظيم التحول إلى المزيد من الفجوات ، والتي عند تغليفها بغشاء أحادي الطبقة ، تسمى phagophores (والتي قد تتشكل من أغشية ER الموسعة جزئيًا ، انظر الأشكال 6B-c ، 6B -d و Bf). عندما تلتف صهاريج البلعمة الممتدة حول جزء من السيتوبلازم و / أو العضيات ، يتم تشغيل الالتهام الذاتي. أثناء عملية النضج البلعومي ، يتم تسليم السيتوبلازم المنفصل الذي يبتلع بواسطة phagophore إلى التجويف الداخلي / الليزوزومي عن طريق أحداث الاندماج بين البلعمة الذاتية والحويصلات الداخلية و / أو الليزوزومية. يتم بعد ذلك تحلل كل من السيتوبلازم والغشاء المحيط به بواسطة hydrolase الليزوزومي ، ويتم نقل منتجات التحلل مرة أخرى إلى السيتوبلازم حيث يمكن إعادة استخدامها لعملية التمثيل الغذائي. جنبًا إلى جنب مع بياناتنا ، يؤدي توسع ER الناجم عن ERS إلى تكوين البلعوم الذاتي في خلايا هيلا المنقولة بواسطة TMV-RNA.

توفر هذه الدراسات بعض الأدلة على مسار الالتهام الذاتي الناجم عن TMV-RNA. بمجرد دخول TMV-RNA إلى خلايا هيلا ، فإنه يصنع أولاً البروتينات في ER ، كما يتضح من CP في ER. مع تراكم بروتينات TMV في ER ، تختبر الخلايا ERS وتنشط مرافقي ER (مثل GRP78 في تجويف ER) لزيادة قدرة طي البروتين. إذا تم إنتاج ما يكفي من بروتينات TMV بحيث يتم تجاوز قدرة GRP78 ، فإن ERS يحفز نهايات أغشية ER على التوسع لزيادة العزل في الفجوات التي قد يتم فيها إنتاج بروتينات TMV (مثل CP). يتم لف هذه الفجوات الجديدة بسرعة بواسطة phagophores (والتي من المحتمل أيضًا أن تنشأ من ER وتبدو مثل الشوكات في الصور المجهرية الإلكترونية لدينا) التي تشكل مزيدًا من البلعمة الذاتية. أخيرًا ، مع اندماج autophagosomes و lysosomes ، تتشكل autolysosomes لهضم محتويات الفراغ ، نقترح أن هذه المحتويات الفراغية قد لا يتم هضمها ، ولكن بدلاً من ذلك ، يحدث الهروب المناعي من خلال آلية جزيئية غير معروفة. يتم دعم التأكيد الأخير من خلال دليلنا على تراكم بروتينات TMV على أغشية البلعمة الذاتية وحولها ، من خلال زيادة CP في ER وإثراء RNA إيجابي TMV في النواة. في الختام ، يستحث TMV-RNA البلعمة الذاتية المرتبطة بـ ERS في خلايا هيلا ، وآلية دفاع محتملة تتضمن البلعمة الذاتية المرتبطة بـ ERS و ERS المستخدمة من قبل خلايا هيلا ضد TMV-RNA تم تصميمها في الشكل 7.

رسم تخطيطي لآلية الدفاع الذاتي المحتملة المرتبطة بـ ERS التي تستخدمها خلايا هيلا ضد TMV-RNA

بعد دخول TMV-RNA إلى خلايا هيلا ، يتم ترجمته إلى بروتين بواسطة الريبوسومات الموجودة على غشاء ER. من المحتمل أن يتم التعرف على بروتينات TMV ، مثل CP ، كبروتينات أجنبية أو غير مطوية في تجويف ER وتسبب ERS. GRP78 هو علامة ERS ، يتم التعبير عنه بشكل كبير ويعمل كمرافق للمساعدة في طي CP. إذا كانت كمية CP كبيرة جدًا ، فقد يترك GRP78 CP ويحفز النهاية البعيدة لأغشية ER لتتوسع وتنتفخ لعزل CP في فجوات. سيتم تغليف هذه الفجوات الجديدة بسرعة بواسطة phagophores ، والتي من المحتمل أن تنشأ من ER. تشبه حوامل البلعمة الجديدة الشوكات الممتدة نحو الفجوة ، وهي تبتلعها لتعزيز النضج في جسيمات البلعمة ذات الغشاء المزدوج. أخيرًا ، عن طريق الاندماج مع الجسيم الحال ، تصبح الجسيمات الذاتية ذاتية الغشاء ذات هيكل أحادي الغشاء. يتم تدهور غالبية حمل CP. في مسار بديل ، قد لا يتحلل الشلل الدماغي وبدلاً من ذلك يحقق الهروب المناعي من خلال آلية جزيئية غير معروفة.

بعد دخول TMV-RNA إلى خلايا هيلا ، يتم ترجمته إلى بروتين بواسطة الريبوسومات الموجودة على غشاء ER. من المحتمل أن يتم التعرف على بروتينات TMV ، مثل CP ، كبروتينات أجنبية أو غير مطوية في تجويف ER وتسبب ERS. GRP78 هو علامة ERS ، يتم التعبير عنه بشكل كبير ويعمل كمرافق للمساعدة في طي CP. إذا كانت كمية CP كبيرة جدًا ، فقد يترك GRP78 CP ويحفز النهاية البعيدة لأغشية ER لتتوسع وتنتفخ لعزل CP في فجوات. سيتم تغليف هذه الفجوات الجديدة بسرعة بواسطة phagophores ، والتي من المحتمل أن تنشأ من ER. تشبه حوامل البلعمة الجديدة الشوكات الممتدة نحو الفجوة ، وهي تبتلعها لتعزيز النضج في جسيمات البلعمة ذات الغشاء المزدوج. أخيرًا ، عن طريق الاندماج مع الجسيم الحال ، تصبح الجسيمات الذاتية ذاتية الغشاء ذات هيكل أحادي الغشاء. يتم تدهور غالبية حمل CP. في مسار بديل ، قد لا يتحلل الشلل الدماغي وبدلاً من ذلك يحقق الهروب المناعي من خلال آلية جزيئية غير معروفة.


المواد والأساليب

المواد النباتية وسلالات الفيروسات والتلقيح الفيروسي

نيكوتيانا تاباكوم و نيكوتيانا بنتاميانا نمت كما هو موصوف (Harries et al. ، 2008). تم استخدام سلالة U1 للفيروس المنقى (Shintaku et al. ، 1996)] أو فيروس من المستخلصات النباتية TVCV و CMV و PVX (Yang et al. ، 2004) في بعض الدراسات. تم الحصول على المستخلصات النباتية التي تحتوي على TVCV ، CMV ، أو PVX عن طريق طحن أنسجة الأوراق المصابة في النيتروجين السائل متبوعًا بإضافة ما يقرب من 2 مجلدين من محلول فوسفات الصوديوم 0.1 م (الرقم الهيدروجيني 7). المستخلصات الخام أو سلالة TMV U1 المنقاة المخففة بمحلول الفوسفات ، ثم تم تلقيحها مباشرة في النباتات التي تم غبارها بالكاربوراندوم (330 حصى ، فيشر) ، كما هو موصوف (Ding et al. ، 1998). أجريت دراسات إضافية باستخدام البلازميدات ترميز TMV. MP.GFP. CP (يشار إليها سابقًا باسم TMV- MP-GFP- CP) ، TMV. MP-GFP (يشار إليها سابقًا باسم TMV- MP: GFP) و TMV. MP-GFP. CP (يشار إليها سابقًا باسم TMV- MP: GFP- CP Cheng et al. ، 2000 Liu et al. ، 2005) و TVCV-GFP و TBSV-GFP و PVX-GFP (المصادر الموضحة في Harries et al. ، 2009 ). تم الحصول على النصوص المعدية الفيروسية من 1 ميكروغرام من DNA البلازميد الخطي باستخدام T7 / T3 / SP6 mMessage mMachine المناسب في مجموعة النسخ المختبرية (Ambion). تم تلقيح أوراق النبات ميكانيكيًا بنصف تفاعل النسخ باستخدام الكربوراندوم كمادة كاشطة. تم وضع النباتات الملقحة بالفيروس إما في غرفة النمو أو الدفيئة. كانت ظروف غرفة النمو 23 درجة مئوية +/ 1 درجة مئوية مع 16 ساعة من الضوء (حوالي 155 ميكرولتر م -2 ث -1) و 8 ساعات من الظلام. كانت ظروف الدفيئة 24 درجة مئوية +/ 2 درجة مئوية مع 16 ساعة إضاءة إضافية (400 ميكرولتر م -2 ثانية -1) و 60٪ رطوبة.

عزل وتنقية مجمع النسخ المتماثل TMV

تمت تنقية الكسور المحتوية على نسخة متماثلة من الحمض النووي الريبي TMV من العدوى ن. تاباكوم "Xanthi-nn" كما هو موصوف (عثمان وباك ، 1997). أوراق من ن. تاباكوم النباتات الملقحة بـ TMV (سلالة U1) تم حصادها بدقة 4 نقطة في البوصة وتم تجانسها في المخزن المؤقت B. تم عزل مجمع TMV المتماثل بشكل أكبر عن طريق الطرد المركزي التفاضلي لإعطاء 30000ز بيليه ، الذي تعرض لمزيد من التدرج اللوني لكثافة Suc (20٪ إلى 60٪ [وزن / وزن] في محلول Tris-EDTA-dithiothreitol (TED)) بالطرد المركزي. يتكون المخزن المؤقت TED من 50 ملي تريس- حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) ، 10 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ، 1 ملي ديثيوثريتول و 5 ٪ (المجلد / المجلد) الجلسرين. تم تحليل الكسور المتدرجة لكثافة Suc لنشاط RNA POL كما وصفه Osman and Buck (1997) مع بعض التعديلات التي تمت مناقشتها أدناه. تم اختيار الكسور النشطة (الكسور 4 و 5 من الأعلى) لمزيد من التنقية. تم تخفيفها 10 أضعاف باستخدام عازلة TED ، وطردها عند 40.000ز، وتم إذابة الحبيبات الناتجة المحتوية على RNA POL المرتبط بالغشاء الخام مع taurodeoxycholate الصوديوم وتعرض لكروماتوجرافيا تبادل الأنيون على DEAE-Bio-Gel A (Bio-Rad) و High Q (Bio-Rad) باستخدام نظام HPLC (Pharmacia) ) كما هو موضح سابقًا (عثمان وباك ، 1997). ثم تم فحص الكسور المجمعة لنشاط RNA POL. تم إجراء التفاعلات باستخدام 50 ميكرولتر من تحضير RNA POL مضافًا إلى 50 ميكرولتر 2 × المخزن المؤقت B الذي يحتوي على 2 مم ATP ، 2 مم GTP ، 2 مم CTP ، 20 ميكرومتر UTP ، 10 µCi [α- 32 P] UTP ، والبنتونيت ( 4.8 مجم / مل). تم إجراء التفاعلات لمدة ساعة عند 30 درجة مئوية. تم عزل منتجات التفاعل عن طريق استخراج الفينول وترسيب الإيثانول وتعليقه في 10 ميكرولتر من محلول Tris-EDTA (10 م م تريس- حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 1 م م EDTA) وتم تحليلها بواسطة PAGE التي تحتوي على 8 م يوريا متبوعة بالتصوير الشعاعي الذاتي. تم تحليل الكسور التي تظهر أعلى نشاط RNA POL لتكوين البروتين باستخدام 4٪ إلى 15٪ SDS-PAGE ، متبوعًا بتلطيخ البروتين باستخدام مجموعة Bio-Rad Silver Stain Plus. تم تنفيذ إجراءات مماثلة باستخدام أنسجة من نباتات غير مصابة للحصول على عينات تحكم. تم إجراء الختان ، والهضم التجريبي في الهلام ، وتحليل الطيف الكتلي لعصابات البروتين الفردية كما هو موصوف (Watson et al. ، 2003).

تم الحصول على كسور VRC الخام كما هو موصوف (Covey and Hull ، 1981) مع التعديلات التالية. تم استخراج الأنسجة بدقة 4 نقطة في البوصة باستخدام TMV (سلالة U1) معبرة عن اندماج MP-GFP و CP عندما كان الفيروس في مرحلة النسخ القصوى وكان MP-GFP موجودًا في VRC ، وبالتالي توفير علامة لهذا المجمع (Liu et al. ، 2005). تم طحن الأوراق في النيتروجين السائل ، متبوعة بإضافة المخزن المؤقت A (50 م تريس- حمض الهيدروكلوريك ، الأس الهيدروجيني 7.6 ، 60 م كلوريد البوتاسيوم ، 6 م م 2-مركابتوإيثانول ، ومثبط البروتياز الكامل الخالي من EDTA [روش]) عند 4 درجات مئوية. ثم يتم ترشيح المستخلص من خلال ثماني طبقات من قماش الجبن. تم إخضاع المرشح للطرد المركزي عند 2000ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم تعليق جزء الحبيبات في المخزن المؤقت A الذي يحتوي على Triton X-100 (1 ٪) و EDTA (5 م م) وتم طرده بالطرد المركزي عند 2000ز لمدة 10 دقائق. تم تكرار عملية الطرد المركزي أعلاه مرتين وأعيد تعليق الحبيبات النهائية في المخزن المؤقت A المحتوي على الجلسرين (15٪). تم تحليل TMV VRCs المنقى من أجل التألق من GFP من خلال الفحص المجهري متحد البؤر. تم فصل البروتينات الموجودة في الكسور المخصبة لـ GFP بواسطة SDS-PAGE (Laemmli ، 1970) وتم تصورها من خلال تلطيخ الفضة كما هو موصوف (Blum et al. ، 1987). تم إجراء الختان ، والهضم التجريبي في الجل ، وتحليلات النانو- LC-MS / MS لعصابات البروتين الفردية كما هو موصوف (Lei et al. ، 2005).تم إجراء تحديد البروتين من خلال البحث في قاعدة بيانات البروتين غير المضاف للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية.

VIGS يبني والتصفية الزراعية

مكتمل الطول ATpC و RCA تسلسل الحمض النووي (كدنا) التكميلي من ن. تاباكوم تم تضخيمها بواسطة RT-PCR باستخدام النسخ العكسي لفيروس سرطان الدم من Moloney Murine (Promega) ، و exTaq POL (Takara) ، و oligo dT ، والبادئات الخاصة بالجينات (الجدول الإضافي S1). تم استنساخ cDNAs كاملة الطول في pCR-Blunt II-TOPO وفقًا للتعليمات (Invitrogen). جزء 425 نقطة أساس من إطار القراءة المفتوح لـ ATpC و RCA تم تضخيمها بواسطة PCR باستخدام exTaq POL والبادئات الخاصة بالجينات (الجدول الإضافي S1) ، المتسلسلة ، والمستنسخة في ناقل الإسكات ، pTRV2 (Liu et al. ، 2002) ، باستخدام تقنية استنساخ البوابة (Invitrogen). يبني pTRV1 و pTRV2 بتنسيق أغروباكتريوم توميفاسيانز نمت وتسللت إلى بنثاميانا الأوراق كما هو موصوف (Ding et al. ، 2004). تم تأكيد إسكات الجينات عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي القياسي والتحليل الكمي RT-PCR.

إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي والتحليل الكمي RT-PCR

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من أنسجة الأوراق باستخدام مجموعة صغيرة من نبات RNeasy (Qiagen) وتم معالجتها باستخدام DNase I. تم تصنيع First-strand cDNA باستخدام 12 إلى 18 قاعدة oligo (dT) التمهيدي (Invitrogen) وعكس فيروس سرطان الدم Moloney Murine إنزيم المنتسخة (بروميغا). تم استخدام ميكرولتر من (كدنا) مخفف بمقدار 20 ضعفًا ، وأشعال خاصة بالجينات ، ومزيج Power SYBR Green الرئيسي (النظم البيولوجية التطبيقية) لتحليلات RT-PCR الكمية لـ ATpC و Rca مستويات mRNA مع نظام الكشف عن التسلسل ABI Prism 7900 HT (النظم البيولوجية التطبيقية). لتطبيع مستويات mRNA للجينات المستهدفة بين العينات ، تم تحديد مستويات EF1α mRNA النسبية باستخدام الاشعال الخاصة بـ EF1α وطريقة القياس الكمي النسبي (Pfaffl ، 2001). تم تحديد تأثير عدوى الفيروس على مستويات EF1α و ubiquitin mRNA أيضًا من خلال هذه الطريقة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد مستويات الفيروس في الأنسجة من خلال النسخ العكسي و PCR الكمي باستخدام بادئات خاصة بالفيروس. لإنشاء منحنيات قياسية مستخدمة لقياس مستويات الفيروس ، تم عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي من الأنسجة المصابة من خلال إجراءات خاصة بالفيروس: TMV و TVCV (Bruening et al.، 1976 Gooding and Hebert، 1967)، PVX (AbouHaidar et al.، 1998 Francki and McLean ، 1968) ، و CMV (Roossinck and White ، 1998). تم قياس كمية الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة القياس الطيفي. تم قياس مستويات الحمض النووي الريبي الفيروسي من أنسجة العلاج من خلال مقارنة قيم عتبة الدورة التي تم الحصول عليها خلال RT-PCR الكمي مع قيم عتبة الدورة التي تم الحصول عليها من الأنسجة الملقحة بالجرعات المزودة بكميات معروفة من الحمض النووي الريبي الفيروسي. يستخدم التوليف العكسي حبلا SSRT III (Invitrogen). يتم توفير مواد أولية لجميع تفاعلات RT-PCR الكمية (الجدول الإضافي S1).

التحليل الإحصائي لأرقام VRC وأحجامها بتنسيق ATpC- و Rca- صامتة مقارنةً بمحطات التحكم المصابة بالعدوى الوهمية و TRV باستخدام نماذج مختلطة خطية أو خطية معممة (رقم: إجراء GENMOD ، الحجم: إجراء مختلط) مع قياسات متكررة في SAS 9.3 (SAS Institute ، Inc.). حسب الضرورة ، تم تحويل البيانات لتلبية افتراضات الفروق المتساوية بين الوسائل. تستخدم مقارنات يعني العلاج الفردي تعديل Tukey-Kramer من ص القيم.

إليسا

لتحليلات ELISA ، تم حصاد الأقراص ذات الحجم المتساوي التي تحتوي على أنسجة من خارج محيط أكبر آفة فلورية خضراء عند نقطة معينة في البوصة ، كما هو موضح في النتائج ، وتم تجميدها في النيتروجين السائل. تم طحن الأنسجة المجمدة في 100 ميكرولتر من محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) (0.14 م كلوريد الصوديوم ، 3 مم بوكل ، 10 مم فوسفات مؤقت ، درجة الحموضة 7.0) ، وتم إجراء ELISAs لتراكم TMV CP كما هو موصوف (ديريك وآخرون ، 1997).

تُنشئ ضريبة السلع والخدمات والمقايسة المنسدلة

تم استنساخ شظايا (كدنا) من MT (نيوكليوتيدات 69-959) ، الأول ، الثاني (نيوكليوتيدات 956-2487) ، هيل (نيوكليوتيدات 2483-3416) ، و POL (نيوكليوتيدات 3421-4916) في نطاقات 126- / 183 كيلو دالتون. pGEX-5X-2 (GE Lifesciences) ويتم التعبير عنها في الإشريكية القولونية. ارتبطت مجالات MT و I-II و HEL و POL المعبر عنها GST أو GST-fused بـ 50 ميكرولتر من الجلوتاثيون سيفروز 4B وفقًا للتعليمات (GE Lifesciences). جزء طاف (S30) من ن. تاباكوم تم تحضيره كما هو موضح سابقًا (Yamaji et al. ، 2006). تم تحضين الأنابيب التي تحتوي على كميات متساوية تقريبًا من اندماج الجينات لفيروس GST أو GST المرتبط بحبات سيفروز ، كما هو محدد من خلال تحليل SDS-PAGE للخرز المرتبط ، مع 200 ميكرولتر من جزء S30 في المخزن المؤقت لتفاعل البروتين (يحتوي PBS على 1 ٪ Triton X- 100 ، 0.5٪ NP-40 ، 0.1٪ SDS ، و 1 متر فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد) لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. تم غسل الحبيبات ثلاث مرات ، مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ٪ تريتون X-100 ومرة ​​واحدة في برنامج تلفزيوني. تمت إزالة الكسور غير المقيدة وتم تسخين الحبيبات المرتبطة في المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وطردها عند 18000ز لمدة 5 دقائق. تم حل المادة الطافية على 4٪ إلى 10٪ SDS-PAGE وتعريضها للتخثر المناعي.

إجمالي استخراج البروتين وفحوصات اللطخة الغربية

تم طحن الأنسجة النباتية المجمدة في النيتروجين السائل إلى مسحوق ناعم وتم إذابتها في محلول استخلاص البروتين (5 م تريس- حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8.0 ، 150 م كلوريد الصوديوم ، 2 م م MgCl2، 50 م بوكل ، 1٪ تريتون X-100 ، 0.5 م م ديثيوثريتول) تحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني (cOmplete EDTA-free ، Roche 1 tablet / 50 ml). تم وضع العينات على الجليد لمدة 30 دقيقة وطردها عند 18000ز لمدة 10 دقائق. تم غلي خمسة عشر ميكروغرامًا من كل عينة بروتين في المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وطردها عند 18000.ز لمدة 5 دقائق. تم حل المادة الطافية في 4٪ إلى 10٪ SDS-PAGE وتقطيعها كهربائياً لأغشية ثنائي فلوريد البولي فينيلدين (Immun-Blot، Bio-Rad). تم حظر البقع باستخدام محلول ملحي يحتوي على 5 ٪ من الحليب منزوع الدسم من Tris وتم فحصه باستخدام الأجسام المضادة الأولية المناسبة من الأرانب ، أو مضاد RCA (1: 7000 تخفيف) ، أو مضاد لـ GFP (0.5 ميكروغرام / مل منتجات أبحاث BioVision). تم غسلها بعد ذلك في محلول ملحي مخزّن من Tris يحتوي على 0.05 ٪ توين 20 وتم اختبارها باستخدام جسم مضاد ثانوي مترافق مع الفوسفاتيز القلوي المضاد للأرانب (Promega). تم الكشف عن البروتينات المناعية عن طريق التفاعل اللوني باستخدام nitroblue tetrazolium و 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate-ص- تولويدين (بروميغا).

المجهر

تم التقاط صور الآفة الفيروسية الفلورية باستخدام مجسم مجسم مضيء أوليمبوس SZX-12 (أوليمبوس). تم قياس مناطق الآفة (البكسل) باستخدام برنامج MetaMorph 4.5 (التصوير العالمي). TMV. تم تصوير MP-GFP VRCs على نموذج Bio-Rad 1024ES. تمت معالجة الصور باستخدام Adobe Photoshop. كان GFP متحمسًا باستخدام خط 488 نانومتر من ليزر الكريبتون / الأرجون وتم التقاط الانبعاثات عند 522 نانومتر.

التوطين الخلوي لـ AtpC و RCA

مكتمل الطول ATpC و Rca تم استنساخ إطارات القراءة المفتوحة في بلازميد 5G-mCherry C1 ، تم الحصول عليها من Dr. Elison Blancaflor (مؤسسة نوبل) وتم إدخالها في A. الورم GV2260 عن طريق التثقيب الكهربائي. للدراسات حول تفاعل AtpC و RCA مع اندماج البروتين GFP 126 كيلو دالتون المعبر عنه خارجياً ، A. الورم يحتوي على انصهار بروتين GFP 126 كيلو دالتون تم ترشيحه معًا A. الورم تحتوي على AtpC-mCherry أو Rca-mCherry باستخدام حقنة بدون إبرة ولاحظت 2 نقطة في البوصة. للدراسات التي تتضمن تحديًا لاحقًا للفيروس ، بنثاميانا تم اختراق الأوراق مع حقنة A. الورم تحتوي ATpC-مشيري أو Rca-mCherry وتوضع في غرفة النمو لمدة 2 د. ثم تم تلقيح الأوراق التي تعبر عن AtpC-mCherry أو RCA-mCherry بـ TMV. MP-GFP ، و 4 نقطة في البوصة ، تم تصوير الخلايا المصابة باستخدام نظام متحد البؤر للقرص الدوار Perkin-Elmer UltraView ERS إلى جانب مجهر مقلوب Zeiss Observer D1. تمت ملاحظة الخلايا بهدف الغمر بالماء بمقدار 63 ×. كان GFP متحمسًا عند 488 نانومتر ، وتم اكتشاف الانبعاث عند 510 نانومتر. تم الكشف عن تألق البلاستيدات الخضراء عن طريق الإثارة عند 647 نانومتر ، وتم الكشف عن الانبعاث عند 680 نانومتر. كان mCherry متحمسًا عند 587 نانومتر ، وتم اكتشاف الانبعاث عند 610 نانومتر.

يمكن العثور على بيانات التسلسل من هذه المقالة في مكتبات بيانات GenBank / EMBL ضمن أرقام الانضمام X63606 و Z14980.

البيانات التكميلية

الشكل التكميلي S1. تحليل الكسور لبروتينات TMV 126- و 183 كيلو دالتون ونشاط RNA POL.

الشكل التكميلي S2. عدم وجود تآزر AtpC- أو RCA-mCherry مع TMV.MP-GFP في خلايا البشرة من بنثاميانا.

الشكل التكميلي S3. عدم وجود تزاوج ATpC- أو RCA-mCherry مع اندماج بروتين GFP 126 كيلو دالتون في خلايا البشرة من بنثاميانا.

الشكل التكميلي S4. تستضيف مستويات EF1α و ubiquitin mRNA في ن. تاباكوم تحدى مع TVCV و CMV و PVX.

الشكل التكميلي S5. تحليل تراكم الفيروس في مقتطفات من النباتات معارضة للتحليل ATpC و Rca مستويات مرنا في الشكل 2.

الشكل التكميلي S6. ATpC و Rca مرنا إسكات الأنماط الظاهرية في بنثاميانا النباتات.

الشكل التكميلي S7. تأثير ATpC أو Rca إسكات الحركة بين الخلايا لـ TBSV-GFP و PVX-GFP.

الجدول التكميلي S1. الاشعال لبنى VIGS والتحليلات الكمية RT-PCR.


شاهد الفيديو: الأحياء متقدم- صف 11 - الحمض النووي الرايبوزي (أغسطس 2022).