معلومة

13: الإفراط في التعبير عن البروتين - علم الأحياء

13: الإفراط في التعبير عن البروتين - علم الأحياء



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في هذا المعمل ، ستستخدم مصادر كربون مختلفة لمعالجة تعبير بروتينات الانصهار Met و LacZ في
الخلايا التي تم تحويلها عن طريق الإفراط في التعبير البلازميدات. يرتبط عامل النسخ Gal4p (أعلاه) بـ
ال GAL1 المروج في البلازميدات ويتحكم في التعبير البروتيني. في هذا المختبر ، سوف تقوم بإعداد البروتين
مقتطفات من الخلايا التي تنمو في ظل ظروف مكبوتة ومستحثة لتحليلها لاحقًا.


أهداف

في نهاية هذا المعمل ، سيتمكن الطلاب من ذلك

  • قارن تأثيرات مصادر الكربون المختلفة على نسخ الجينات التي تتحكم فيها الخميرة GAL1 المروجين.
  • اشرح دور الحرارة والمنظفات في تحضير مستخلصات خلايا الخميرة.
  • ثقافة الخميرة بمصادر كربون مختلفة للحث أو قمع التعبير من GAL1 المروجين.
  • تحضير المستخلصات من سلالات الخميرة المحولة المناسبة للاستخدام في المواد الهلامية SDS-PAGE والبقع الغربية.

خلال الأسابيع القليلة القادمة ، ستقوم بتحليل تعبير S. بومبي و س. الخبازبروتينات الانصهار المتقاربة أو البكتيرية في سلالاتك المتحولة. لقد اختبرت بالفعل قدرة بلازميدات الإفراط في التعبير على تكملة التقى طفرة في سلالات الخميرة. يعتمد التكميل على وجود بروتينات Met الوظيفية. إذا لاحظت فشلًا في استكمال ملف التقى نقص ، يمكن أن يشير هذا إلى أن البروتينات لم يتم التعبير عنها من البلازميدات. بدلاً من ذلك ، قد تكون البروتينات المفرطة التعبير موجودة ، ولكنها لا تعمل بشكل طبيعي.تذكر أن البروتينات المعبر عنها من بلازميدات BG1805 و pYES2.1 عبارة عن بروتينات اندماجية مع تسلسلات إضافية في الطرف C (Gelperin) وآخرون.، 2005). لم يتم تقييم الأنشطة الكيميائية الحيوية لبروتينات الاندماج سابقًا. (نحن أول من اختبر ما إذا كانت بروتينات الانصهار Met تعمل بشكل مشابه للوضع الطبيعي S. cerevisiae البروتينات!)

في هذه التجربة ، ستقوم بإعداد مقتطفات من الخميرة لتجارب لاحقة (الفصول 14 و 15) والتي ستحدد فيها ما إذا كان يتم التعبير عن بروتينات الانصهار Met و LacZ بنجاح في سلالات الخميرة المحولة وكيف يختلف التعبير عن بروتينات الاندماج مع مصادر الكربون.


نظرة عامة على تعبير البروتين

يتم تصنيع البروتينات وتنظيمها حسب الحاجة الوظيفية في الخلية. يتم تخزين المخططات الخاصة بالبروتينات في الحمض النووي وفك تشفيرها عن طريق عمليات نسخ منظمة للغاية لإنتاج مرسال الحمض النووي الريبي (مرنا). ثم تُترجم الرسالة المشفرة بواسطة mRNA إلى بروتين. النسخ هو نقل المعلومات من DNA إلى mRNA ، والترجمة هي تخليق البروتين بناءً على تسلسل محدد بواسطة mRNA.

رسم تخطيطي بسيط للنسخ والترجمة. يصف هذا التدفق العام للمعلومات من تسلسل زوج قاعدة الحمض النووي (الجين) إلى تسلسل متعدد الببتيد الأحماض الأمينية (البروتين).

في بدائيات النوى ، تحدث عملية النسخ والترجمة في وقت واحد. تبدأ ترجمة الرنا المرسال حتى قبل أن يتم تصنيع نسخة كاملة من الرنا المرسال الناضج. يسمى هذا النسخ والترجمة المتزامنة للجين بالنسخ المقترن والترجمة. في حقيقيات النوى ، يتم فصل العمليات مكانيًا وتحدث بالتتابع مع حدوث النسخ في النواة والترجمة ، أو تخليق البروتين ، الذي يحدث في السيتوبلازم.

مقارنة النسخ والترجمة في بدائيات النوى مقابل حقيقيات النوى.

يوفر هذا الكتيب المكون من 118 صفحة معلومات شاملة حول تعبير البروتين وسيساعدك على اختيار نظام التعبير الصحيح وتقنيات التنقية لتطبيقك واحتياجاتك المحددة. احصل على النصائح والحيل عند بدء التجربة ، واعثر على إجابات للمشكلات اليومية المتعلقة بتعبير البروتين.

يحدث النسخ في ثلاث خطوات في كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى: البدء والاستطالة والإنهاء. يبدأ النسخ عندما يتم فك الحمض النووي مزدوج الشريطة للسماح بربط بوليميراز الحمض النووي الريبي. بمجرد بدء النسخ ، يتم تحرير بوليميراز الحمض النووي الريبي من الحمض النووي. يتم تنظيم النسخ على مستويات مختلفة بواسطة المنشطات والمثبطات وأيضًا عن طريق بنية الكروماتين في حقيقيات النوى. في بدائيات النوى ، لا يلزم إجراء تعديل خاص على mRNA وتبدأ ترجمة الرسالة حتى قبل اكتمال النسخ. ومع ذلك ، في حقيقيات النوى ، تتم معالجة الرنا المرسال بشكل أكبر لإزالة الإنترونات (الربط) ، إضافة غطاء في نهاية 5´ وأدينينات متعددة في نهاية mRNA 3´ لتوليد ذيل بولي أ. ثم يتم تصدير mRNA المعدل إلى السيتوبلازم حيث يتم ترجمته.

الترجمة أو تخليق البروتين هي عملية متعددة الخطوات تتطلب جزيئات كبيرة مثل الريبوسومات ونقل الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي) وعوامل الرنا المرسال والبروتين بالإضافة إلى الجزيئات الصغيرة مثل الأحماض الأمينية و ATP و GTP والعوامل المساعدة الأخرى. هناك عوامل بروتينية محددة لكل خطوة من خطوات الترجمة (انظر الجدول أدناه). العملية الكلية متشابهة في كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى ، على الرغم من وجود اختلافات معينة.

أثناء البدء ، تقوم الوحدة الفرعية الصغيرة للريبوسوم المرتبط بالبادئ t-RNA بمسح الحمض النووي الريبي الذي يبدأ في الخامس من أجل تحديد وربط كودون البدء (AUG). تنضم الوحدة الفرعية الكبيرة للريبوسوم إلى الوحدة الفرعية الريبوسومية الصغيرة لتوليد مجمع البدء في كودون البدء. تشارك عوامل البروتين وكذلك التسلسلات في mRNA في التعرف على كودون البدء وتشكيل مجمع البدء. أثناء الاستطالة ، ترتبط الحمض النووي الريبي بالأحماض الأمينية المحددة (المعروفة باسم شحن الحمض النووي الريبي) وتنقلها إلى الريبوسوم حيث يتم بلمرتها لتشكيل ببتيد. يعتمد تسلسل الأحماض الأمينية المضافة إلى الببتيد المتنامي على تسلسل الرنا المرسال للنسخة. أخيرًا ، يتم تحرير البولي ببتيد الناشئ في خطوة الإنهاء عندما يصل الريبوسوم إلى كود الإنهاء. في هذه المرحلة ، يتم تحرير الريبوسوم من الرنا المرسال ويكون جاهزًا لبدء جولة أخرى من الترجمة.


مقدمة

فهم بيولوجيا طفيلي الملاريا القاتل ، المتصورة المنجلية، ضروري لتطوير خيارات علاجية جديدة في ضوء تزايد حالات مقاومة الأدوية المضادة للملاريا. تم توثيق دور المرافق الجزيئية ، من بينها بروتينات الصدمة الحرارية (Hsps) في تطور طفيليات الملاريا ، [1] [2] [3]. يلعب Hsps دورًا مهمًا في الحفاظ على المنزل في الخلية من خلال تسهيل طي البروتين والحفاظ على مراقبة الجودة [4] [5]. تم الإبلاغ عن التعبير المنظم لبعض Hsps ، ليكون حاسمًا لتطوير طفيليات الملاريا في المضيف [6] [7]. كما تم اقتراح أن التعبير عن طفيلي معين Hsps يرتبط بالتقدم السريري للمرض [8]. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر بعض Hsps ضرورية لجدوى الطفيليات ، بينما تم اقتراح البعض الآخر كأهداف محتملة للأدوية المضادة للملاريا [1] [3] [6] [7].

تتورط Hsp70s في تحلل البروتين ، وانتقال البروتين وتجميع وتفكيك المجمعات قليلة القسيمات [9] [10] [11]. تتكون مرافقات Hsp70 من مجال ربط النوكليوتيدات N-terminal (NBD) ، والذي يمنحهم نشاط ATPase ومجال ربط الركيزة C (SBD). يتم توصيل المجالين بواسطة مقطع رابط محفوظ بدرجة عالية [12]. تنقسم Hsp70s إلى ثلاث عائلات فرعية: DnaK-like (canonical Hsp70s) Hsp110 و Grp170 [13]. DnaK هو الشكل بدائية النواة لـ Hsp70. DnaK / Hsp70 قادر على إعادة تشكيل البروتين غير المطوي وقمع تراكم البروتين [14]. تعتبر DnaK و Hsp70s الأخرى التي تشبه DnaK بشكل وثيق Hsp70s. من ناحية أخرى ، فإن أعضاء Hsp110 عبارة عن بروتينات متخصصة تختلف هيكليًا عن Hsp70s الكنسي. تم وصفها بأنها عوامل تبادل النيوكليوتيدات (NEFs) من Hsp70s الكنسي [15]. يرتبط أعضاء Hsp110 و Grp170 ارتباطًا وثيقًا ولكن بينما يحدث Hsp110 في النواة والعصارة الخلوية ، يتميز Grp170 بإشارات شبكية إندوبلازمية تقيد توطينه في هذه الحيز الخلوي [13]. يمتلك كل من Hsp110 و Hsp70s الكنسي NBD محفوظًا للغاية و SBD أقل حفظًا جيدًا. يختلف Hsp110 عن Hsp70s الكنسي حيث أن الأول يمتلك مقطع غطاء ممتد [16]. ترتبط Hsp70s المرتبطة بـ ADP بركائزها ذات التقارب العالي وتحررها في حالاتها المرتبطة بـ ATP [17]. يتم تنظيم الدورة بين الدول المرتبطة بـ ADP و ATP بواسطة عوامل تبادل النيوكليوتيدات.

ال ص. المنجلية يشفر الجينوم لـ 6 بروتينات Hsp70 [2]. تحدث البروتينات في حجرات خلوية مختلفة: PfHsp70-1 (PF3D7_0818900) و PfHsp70-z (PF3D7_0708800) (العصارة الخلوية) PfHsp70-2 / PfBiP (PF3D7_0917900) و PfHsp70-y (MAL13Pop1.540) ) (ميتوكوندريا) و PfHsp70-x (PF3D7_0831700) والتي يتم تصديرها إلى عصارة كريات الدم الحمراء التي تمت مراجعتها في [2]. تحظى PfHsp70-z بأهمية خاصة في هذه الدراسة والتي من المتوقع أن تعمل بمثابة NEF لنظيرتها الخلوية ، PfHsp70-1 [2].

من المعروف أن Hsp110s تمنع تراكم البروتين من خلال العمل كحامل ركيزة [18]. لفترة طويلة ، كان دور Hsp110 غير مفهوم جيدًا حتى تم الإبلاغ عن أن الخميرة Hsp110 (Sse1p) و Hsp110 البشري (hHsp110) تعملان كنظرائهما من Hsp70 الكنسي [19]. إن NEFs لـ Hsp70 من بدائيات النوى وحقيقيات النوى متميزة بنيويًا ولكنها تشترك في دور مشترك. الجين E الشبيه بـ GroP (GrpE) هو NEF يحدث في بدائيات النوى والميتوكوندريا [20]. تستخدم حقيقيات النوى العديد من NEFs من بينها ، Bcl2 المرتبط بـ athanagene-1 (حقيبة -1) [21] بروتين ربط بروتين الصدمة الحرارية 1 (HspBP1) [22] و Hsp110 [15]. في ص. المنجلية، يحدث متماثل GrpE في الميتوكوندريا [23] ولا يوجد أي منها مقيم في العصارة الخلوية. أ ص. المنجلية لم يتم تحديد تماثل الحقيبة الخلوية -1. وبالتالي ص. المنجلية يحتمل أن يكون له NEF واحد فقط في PfHsp70-z [24].

على الرغم من أنه يُعتقد أن PfHsp70-z يلعب دورًا أساسيًا من خلال قمع تراكم البروتينات الغنية بالأسباراجين الملاريا [25] ، فمن الممكن أن تكون وظيفته باعتبارها NEF لـ Hsp70 ضرورية لبقاء الطفيل على قيد الحياة [24]. يحدد تبادل النيوكليوتيدات بشكل غير مباشر وقت ركيزة الركيزة على Hsp70 SBD [26]. يمكن أن يؤدي الإطلاق المبكر للركائز من Hsp70 إلى تجميعها ، مما يؤدي إلى تدهورها [10] ومن ثم يعد دور NEFs جانبًا مهمًا لوظيفة Hsp70.

مقاومة الكلوروكين في ص. المنجلية يتم تعيينه إلى مقطع 36 كيلو بايت من الكروموسوم 7 ، والذي يتضمن PfHsp70-ض (PfCg4) الجين [27]. لذلك من المهم وصف دور PfHsp70-z نحو فهم وظائفه الأوسع. على سبيل المثال ، تم تورط مجمعات Hsp110-Hsp70 في انقسام الخلايا حيث تعدل نشاط جزيئات محرك كينيسين -5 و cin8 ، وهما أمران ضروريان لاستطالة المغزل في الخميرة وخلايا الثدييات [28]. قد يكون تعديل استطالة المغزل بواسطة المرافقات الجزيئية آلية يمكن من خلالها التحكم في انقسام الخلايا تحت الضغط البروتيني. دورات النمو السريع ص. المنجلية في المضيف يسهل بقائه وقد يؤثر على مسبباته [29]. على الرغم من أنه من غير المعروف ما إذا كان PfHsp70-z يعدل استطالة المغزل في ص. المنجلية، من المهم توصيف دورها بشكل كامل في بقاء طفيليات الملاريا وتطورها.

في الدراسة الحالية ، قمنا بالتعبير عن البروتين المؤتلف PfHsp70-z وتنقيته وبحثنا في خصائصه الفيزيائية الحيوية. كما قمنا بفحص تعبيره في طفيلي الملاريا المعرض للإجهاد الحراري. تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن PfHsp70-z عبارة عن جزيء مستقر للحرارة ومستقر للحرارة مع نشاط ATPase قادر على تكوين أوليغومرات عالية المستوى. نناقش النتائج التي توصلنا إليها وآثارها على فهمنا لـ PfHsp70-z في تطوير ص. المنجلية.


يمكن تصوير الخلايا على أنها مصانع تبني البروتينات ، وهي الجزيئات الأساسية لجميع عمليات الحياة تقريبًا. يتحكم الجسم بإحكام في مستويات الإنتاج ، لأن إنتاج الكثير من البروتينات - والمعروف أيضًا باسم فرط إفراز البروتين - يمكن أن يكون ضارًا بالخلية. ومع ذلك ، من الصعب معرفة المقدار الذي سيكون ضارًا من أي بروتين معين ، أو لماذا.

في الواقع ، يمكن للتركيزات العالية من الإنزيمات والبروتينات الأخرى أن تلحق الضرر بالخلايا بعدة طرق ، على سبيل المثال عن طريق تنشيط أو زيادة التحميل على مسارات بيولوجية محددة ، أو تعطيل التنظيم ، أو عن طريق التجميع معًا (Vavouri et al.، 2009 Tang and Amon، 2013 Makanae et al.، 2013). يمكنهم أيضًا الإخلال بالتوازن في مجمعات البروتين أو فصل المراحل السائلة المختلفة في الخلية (Birchler and Veitia ، 2012 Bolognesi et al. ، 2016). في النهاية ، فإن الإفراط في التعبير عن أي بروتين سيكون مدمرًا لأنه يستنفد موارد الخلية لصنع ونقل البروتينات (Stoebel et al. ، 2008). ومع ذلك ، لم نكن نعرف الكمية التي يجب إنتاجها من بروتين معين للتسبب في "عبء البروتين" هذا وإعاقة نمو الخلايا.

الآن ، في eLife ، أفاد هيساو موريا وزملاؤه في جامعات أوكاياما وكوبي وميجي - بما في ذلك يويتشي إيجوتشي باعتباره المؤلف الأول - أن العديد من أعضاء مجموعة الإنزيمات يمكن الإفراط في التعبير عنها حتى تشكل 15٪ من إجمالي البروتينات في الخميرة. خلية (Eguchi et al. ، 2018). عندها فقط يبدأون في إحداث ضرر بسبب عبء البروتين. يتطابق هذا مع نتائج التجارب السابقة من نفس المختبر ، والتي ركزت فقط على بروتين فلوري واحد لا يتداخل مع أي من مكونات الخلية (Kintaka et al. ، 2016).

لاكتشاف هذا الحد ، استخدم Eguchi et al. يعتمد على طريقة تم تطويرها في المختبر في عام 2006. تتضمن التقنية إدخال جزء صغير من الحمض النووي ، يسمى البلازميد ، في خلايا الخميرة. يحمل البلازميد جينين: الأول ضروري للنمو ، والآخر رموز لأحد الإنزيمات المدروسة. تحتاج الخلية بشكل متزايد إلى صنع بلازميدات جديدة من أجل النمو ، ولكن هذا أيضًا ينتج المزيد من الإنزيمات. في نظام "شد الحبل" هذا ، تولد الخميرة المزيد والمزيد من البلازميدات حتى يصبح التعبير عن الإنزيم محل الاهتمام ضارًا في هذه المرحلة ، وينخفض ​​إنتاج البلازميد. وبالتالي فإن عدد البلازميدات في الخلية يعكس كمية البروتين التي يمكن تصنيعها قبل أن تصبح سامة.

ركزت التجارب على مجموعة من 29 إنزيم حال للجلوكوز ، والتي تعمل على تكسير السكر في الخميرة. عادة ما يتم التعبير عن هذه الإنزيمات بشكل كبير في الخلية ، وأدوارها مفهومة جيدًا.

من أصل 29 بروتينًا ، لم تكن ثلاثة منها ضارة في التجربة ولا يمكن إنتاجها بكميات عالية بما يكفي للوصول إلى حد العبء. كان هذا لأن الجينات التي قامت بتشفير هذه الإنزيمات تحتوي على تسلسلات لم تكن مثالية لإنتاج البروتين.

يمكن التعبير عن 19 إنزيمًا آخر حتى تشكل ما يقرب من 15٪ من إجمالي محتوى البروتين في الخلية ، مما يشير إلى أن عبء البروتين هو سبب سميتها. حقيقة أنه حتى إنزيمات الخميرة الأساسية الكبيرة يمكن إنتاجها حتى هذا الحد غير متوقعة ، وهي تشير إلى أنه في كثير من الحالات لا تعتمد السمية الناتجة عن فرط إفراز البروتين على الخصائص المحددة للبروتينات.

قد تأتي تكلفة الإفراط في التعبير من العبء الذي تضعه على الآلية التي تجمع البروتينات في الخلية ، والتي تتطلب مستويات عالية من الطاقة بشكل خاص (Shah et al. ، 2013). قد يؤدي وضع هذا الجهاز تحت الضغط إلى إضعافه أو إبطائه بدوره ، مما قد يعيق تكوين البروتينات الأخرى ويقلل من لياقة الخلية. تستخدم الخطوات الأخرى لإنتاج البروتين ، مثل "قراءة" الجينات ، ومساعدة البروتين على النضوج ، وإيصاله إلى موقعه الصحيح في الخلية ، وإفساده ، أيضًا كميات كبيرة من الطاقة (Rice and McLysaght ، 2017).

سببت سبعة بروتينات ضررًا عند تركيزات أقل بكثير من حد 15٪ ، مما يعني أنها يجب أن تلحق الضرر بالخلية بطرق أخرى غير التسبب في عبء البروتين. إيجوتشي وآخرون. حددت ثلاث آليات لهذه السمية: البروتينات المتجمعة معًا ، أو حملت فوق طاقتها نظام النقل الذي يأخذها إلى حجرة خلية معينة ، أو أن الإنزيمات المفرطة التعبير أنتجت نشاطًا تحفيزيًا أكثر من اللازم (الشكل 1). ربما توقع المرء أن تؤدي هذه العملية الأخيرة إلى إحداث التأثيرات السامة لهذه المجموعة من البروتينات. ومع ذلك ، فإن قتل النشاط التحفيزي في الإنزيمات (عن طريق إدخال طفرات معينة) يخفف فقط من السمية الناتجة عن الإفراط في التعبير لاثنين من البروتينات الـ 18 التي تم اختبارها.

آليات السمية المختلفة التي يسببها الإفراط في التعبير عن البروتين.

العديد من الإنزيمات المشاركة في تحلل السكر مثل GFP أو Pgk1 لا تسبب أي ضرر حتى يتم إفراط في التعبير عنها أو بالقرب من حد عبء البروتين ، والذي يتوافق مع 15 ٪ من إجمالي البروتينات في الخلية. تسبب البروتينات السامة قبل الوصول إلى هذا الحد ضررًا من خلال آليات أخرى غير استنفاد الموارد الخلوية. على سبيل المثال ، بينما لا يزال من الممكن التعبير عن Tpi1 عند مستويات عالية نسبيًا (قريبة من 15٪) ، فإنه يتسبب في تراكم البروتين. لا يمكن التعبير عن إنزيمات مثل Pfk1 أو Adh3 إلا عند مستويات أقل قبل أن تصبح سامة: يتسبب Pfk1 في الكثير من النشاط التحفيزي بينما يقوم Adh3 بزيادة التحميل على أنظمة النقل. بعض البروتينات ، على سبيل المثال Glk1 و Pyk2 و Pdc1 ، ليست ضارة عند الإفراط في التعبير عنها لأنها ببساطة لا تستطيع الوصول إلى حد عبء البروتين. يكون التعبير عن هذه الجينات أقل لأنها تستخدم أكوادًا نادرة (تسلسلات أقل مثالية لإنتاج البروتين).

في كثير من الحالات ، أدت إزالة آلية واحدة من السمية إلى زيادة المستوى الذي يمكن أن يُفرط فيه التعبير عن الإنزيم ، لكنه لا يزال لا يسمح بالتعبير حتى حد 15٪. لذلك يمكن أن تكون البروتينات ضارة من خلال مجموعة من الآليات ، يتم تشغيل كل منها عندما يصل التركيز في الخلية إلى مستوى معين.

بينما تنتمي إنزيمات حال السكر إلى نفس المسار وتشترك في أدوار متشابهة للغاية ، يؤثر إفراطها في نمو الخلايا عبر آليات متنوعة. بمعنى آخر ، لا يمكن استخدام الدور البيولوجي للبروتين للتنبؤ بكيفية إلحاق الضرر بالخلية. إجمالًا ، تحفز هذه النتائج خطوطًا مهمة من الاستقصاء ، مثل النظر في أي من الآليات المذكورة أعلاه تلحق الضرر بالخلايا عندما يتغير التعبير الجيني أثناء المرض. كما أنها تشجع على إجراء مزيد من البحث حتى نتمكن من التنبؤ بالتركيز الذي سيكون فيه تعبير كل جين بشري ضارًا في أي نسيج. وأخيرًا ، يطرحون السؤال التالي: هل عبء البروتين هو ما أوقف زيادة التعبير الجيني أثناء التطور؟


التحول وعزل البلازميد

بمجرد اكتمال الاستنساخ ، يتم نقل البلازميدات إلى خلايا مختصة (مؤهلة كيميائيًا أو ذات كفاءة كهربائية بكتريا قولونية) للتكاثر والتخزين ، من خلال عملية تسمى التحويل. الخلايا المختصة كيميائيًا هي الخلايا المعالجة بالأملاح لفتح المسام في الغشاء وجدار الخلية. ثم يضاف DNA البلازميد إلى الخلايا وصدمة حرارية خفيفة تفتح المسام في الخلايا بكتريا قولونية الخلايا ، مما يسمح بدخول البلازميد. في المقابل ، يتم إدخال الحمض النووي في الخلايا الكهربائية من خلال المسام العابرة التي تتشكل في بكتريا قولونية الغشاء وجدار الخلية عندما يتم توصيل نبضات كهربائية قصيرة إلى الخلية ومزيج DNA البلازميد. عند اختيار سلالة خلية مختصة للعمل معها ، من المهم مراعاة العوامل التالية:

  • الطراز العرقى- قائمة الطفرات الجينية (الحذف أو التغييرات أو الإدخالات) في السلالة التي تميزها عن النوع البري بكتريا قولونية
  • كفاءة التحول- تم تحويل قياس كمية البلازميد فائق الالتفاف (مثل pUC19) بنجاح إلى حجم من الخلايا التي تم تعريفها على أنها وحدات تشكيل مستعمرة لكل ميكروغرام من الحمض النووي الذي يتم تسليمه (cfu / ميكروغرام) نقوم بتصنيع خلايا مختصة لها كفاءات تتراوح من & gt1 x 10 6 إلى & gt3 x 10 10 قدم مكعب / ميكروغرام
  • تطبيق—نوع التجربة التي تكون فيها الخلايا المختصة تطبيقات مناسبة تمامًا تشمل الاستنساخ الروتيني ، وتعبير البروتين ، وإنتاج المكتبات ، واستنساخ الحمض النووي غير المستقر ، وانتشار ssDNA ، وإنشاء bacmid ، وإعادة تركيب Cre-Lox
  • تنسيق المجموعة—تتضمن التنسيقات إنتاجية عالية (96 بئر) أو قارورة Invitrogen One Shot للاستخدام مرة واحدة أو أطقم قياسية أو تنسيق مجمّع

بعد الاستفادة من بكتريا قولونيةالآلية الجزيئية لتكرار DNA البلازميد ، يمكن استخدام مجموعة تنقية البلازميد لتنقية البلازميد.

DNA (يحتوي على الجين الخاص بك). نقدم تقنيتين رئيسيتين لتنقية البلازميد:

لتنقية البلازميد المستنسخ الذي سيتم استخدامه للتحويل إلى خط خلوي لتعبير البروتين ، نوصي بتنقية تبادل الأنيون من أجل نقاء أعلى ومستويات منخفضة من الذيفان الداخلي. التنقية القائمة على السيليكا مناسبة لاستنساخ تدفقات العمل ذات الصلة ، ولكنها ليست مثالية للبلازميدات المستخدمة في تعداء العدوى حيث توجد مستويات أعلى من السموم الداخلية والشوائب. تنتج أعمدة تبادل الأنيون أيضًا نتائج أفضل مع البلازميدات الكبيرة. تم تطوير مجموعات Invitrogen PureLink HiPure Expi Plasmid لإعطاء عوائد أعلى من عزل البلازميد على نطاق واسع ، في أقل من نصف الوقت الذي تستغرقه طرق عزل DNA البلازميد النموذجية.


استنتاج

في هذه الدراسة ، تنبأت المعلومات الحيوية OsMBD تم التحقق من جينات العائلة و 13 OsMBDs تم تحديدها ليتم التعبير عنها بنشاط في أنسجة الأرز المختلفة. لقد أجرينا أيضًا دراسة وظيفية لـ OsMBD707 ، وأظهرنا أن OsMBD707 يتم التعبير عنه بشكل أساسي ومترجم في النواة. الإفراط في التعبير عن OsMBD707 يسبب زوايا أكبر للحراثة ، وتأخر الإزهار تحت SD والزهور المبكر تحت LD في الأرز. كشف تحليل RNA-seq أن الإفراط في التعبير عن OsMBD707 أدى إلى تقليل حساسية الفترة الضوئية في الأرز عن طريق تقليل تنظيم الجينات المعززة للازهار تحت SD والجينات المعززة للازدهار تحت LD. اقترحت نتائجنا الأدوار البيولوجية لـ OsMBD707 في نمو الأرز وتطوره ، ووضع الأساس للدراسات المستقبلية حول وظيفة بروتينات OsMBD في العمليات الجزيئية والخلوية والبيولوجية في الأرز.


عواقب فرط إفراز البروتين

تعتمد الطرق التي يمكن أن يتسبب بها الإفراط في التعبير عن البروتين في حدوث عيوب خلوية على خصائص البروتين ووظائفه (Prelich ، 2012). تم اقتراح العديد من آليات العيوب الخلوية عند الإفراط في التعبير عن البروتينات من تحليلات البروتينات الحساسة للجرعة التي تم الحصول عليها في المطلق على مستوى الجينوم (فافوري). وآخرون.، 2009 أماه وآخرون.، 2010 تومالا وآخرون.، 2014) وتجارب الإفراط النسبي في التعبير (Makanae وآخرون.، 2013) ومن تحليلات فسيولوجيا سلالات الخميرة الذرية (Sheltzer and Amon ، 2011 Tang and Amon ، 2013). أركز هنا على أربع آليات أساسية: الحمل الزائد على الموارد ، وعدم التوازن المتكافئ ، والتفاعلات المختلطة ، وتعديل المسار (الشكل 4). يتم تفسير عيوب النمو إلى حد كبير بالحمل الزائد والسمية (Tomala and Korona ، 2013). الزائد هو بيئة خلوية غير طبيعية تنشأ عن تعزيز النشاط الطبيعي أو معدل دوران البروتين الناجم عن فرط إفرازه. السمية هي تأثير يسبب عيوبًا خلوية بسبب الخصائص الجديدة وغير ذات الصلة الناتجة عن الإفراط في التعبير عن البروتين. يتم التعبير عن الحمل الزائد إما بالحمل الزائد على الموارد أو تعديل المسار. تحدث السمية عن طريق التفاعلات المختلطة. يمكن أن يؤدي عدم التوازن المتكافئ إلى زيادة الحمل والسمية.

الشكل 4: الآليات الأولية للعيوب الخلوية بعد فرط إفراز البروتين. (أ) الموارد الزائدة. عندما يتطلب البروتين كميات كبيرة من الموارد الخلوية للترجمة أو الطي أو التوطين أو التدهور ، فإن الإفراط في التعبير عن البروتين يثقل كاهل تلك الموارد الخلوية. يُعتقد أن تأثير عبء البروتين هو أحد التحميل الزائد لموارد الترجمة (أي الريبوسومات). (ب) عدم التوازن المتكافئ. عندما يكون البروتين وحدة فرعية لمركب بروتيني ، فإن الإفراط في التعبير عن البروتين يعطل قياس العناصر الكيميائية. يتسبب الفائض في الوحدات الفرعية في تعديل المسار ، أو تكوين معقد غير طبيعي ، أو زيادة التحميل على موارد مراقبة جودة البروتين الخلوي. (ج) التفاعل غير الشرعي. يؤدي تعزيز التفاعل بين البروتين والبروتين عند الإفراط في التعبير عن منطقة ID - المحتوية على البروتينات والبروتينات التجميعية إلى تعديل مسار أو عزل البروتينات الأساسية. في ظل الظروف العادية ، يكون المركب A-C إما نادرًا أو غير موجود. (د) تعديل المسار. يؤدي الإفراط في التعبير عن البروتين التنظيمي إلى تعديل المسار. يمكن أن يحدث تعديل المسار عن طريق عدم التوازن المتكافئ والتفاعلات المختلطة. قد يكون لمعظم المنظمين نطاقات تخزين مؤقت كبيرة جدًا لتجنب تعديل المسار غير المناسب (انظر النص). تستند الرسوم البيانية على مستوى لغة وصف العملية 1 من التدوين الرسومي لبيولوجيا الأنظمة (www.sbgn.org/). يشير السهم ذو المربع المفتوح إلى عملية. يشير الخط الذي ينتهي بدائرة إلى التحفيز للعملية التي يرتبط بها. يشير السهم المدمج بدائرة ممتلئة إلى الارتباط ، ويشير السهم المتفرّع بدائرة مزدوجة إلى التفكك. يعكس سمك كل سهم معدل كل عملية. تحدث العمليات الموضحة بالخطوط السوداء في ظروف النمو الطبيعية. يتم تشغيل العمليات الموضحة بخطوط حمراء عند الإفراط في التعبير عن A.


13: الإفراط في التعبير عن البروتين - علم الأحياء

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يمكن إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من قبل المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة ويعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


يؤدي الإفراط في التعبير عن البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة CLIP-170 إلى تكوين بنية فوقية لشبكة + TIP متوافقة مع مكثف جزيئي حيوي

يعد التنظيم السليم لديناميات الأنابيب الدقيقة (MT) أمرًا بالغ الأهمية للعمليات الخلوية بما في ذلك انقسام الخلايا والنقل داخل الخلايا. تتبع بروتينات التتبع الإضافية (+ TIPs) ديناميكيًا النمو في MTs وتلعب دورًا رئيسيًا في تنظيم MT. + تشارك TIPs في شبكة معقدة من التفاعلات داخل الجزيئات وفيما بينها تُعرف باسم شبكة + TIP. تتضمن الفرضيات التي تتناول الغرض من + TIP: + تفاعلات TIP التخفيف + منع TIP التلقائي وتوطين منظمات MT للنهايات المتنامية. بالإضافة إلى ذلك ، اقترحنا أن يكون لشبكة تفاعلات + TIP: + TIP غرضًا ماديًا ، مما يؤدي إلى إنشاء بنية فوقية تقيد التقلبات الهيكلية لطرف MT الهش وبالتالي تعمل بمثابة مساعد البلمرة. العديد من بروتينات شبكة الحيوانات + TIP متعددة التكافؤ ولها مناطق مضطربة جوهريًا ، وهي سمات شائعة في المكثفات الجزيئية الحيوية. تشير هذه الملاحظة إلى أن شبكة + TIP قد تشكل في ظل بعض الظروف مكثفًا جزيئيًا حيويًا. أظهرت الدراسات السابقة أن الإفراط في التعبير عن + TIP CLIP-170 يؤدي إلى تراكيب "رقعة" كبيرة تحتوي على CLIP-170 و + TIPs الأخرى. لاختبار الفرضية القائلة بأن هذه البقع قد تكون مكثفات جزيئية حيوية ، استخدمنا الفحص المجهري بالفيديو ، وتلطيخ التألق المناعي ، واستعادة الإسفار بعد التبييض الضوئي (FRAP). تُظهر بياناتنا أن البقع المستحثة بـ CLIP-170 لها سمات مميزة تدل على مكثف جزيئي حيوي ، يحتوي على بروتينات + TIP ويستبعد علامات التكثيف المعروفة الأخرى. علاوة على ذلك ، تُظهر دراسات المعلومات الحيوية أن وجود المناطق المضطربة جوهريًا يتم حفظه في المفاتيح + TIPs ، مما يعني أن هذه المناطق مهمة وظيفيًا. تشير هذه النتائج معًا إلى أن البقع المستحثة بـ CLIP-170 في الخلايا عبارة عن مكثفات سائلة مفصولة عن الطور وتزيد من احتمال أن تشكل شبكة + TIP الداخلية قطرة سائلة عند أطراف MT أو مواقع أخرى + TIP.


استنتاج

لقد ناقشت الطبيعة الكمية لتجارب الإفراط في التعبير وبعض النتائج الأولية للإفراط في التعبير عن البروتين كما كشفت الدراسات واسعة النطاق. الشكل 2 هو عرض مفاهيمي لتجارب التعبير المفرط المطلق والنسبي. يسمح بفهم حدسي للطبيعة الكمية للإفراط في التعبير ويوضح أهمية قياسات مستويات البروتين المفرطة التعبير. كشفت بعض الدراسات الرائدة عن تنوع مستويات التعبير عن البروتين حتى في تجارب الإفراط في التعبير المطلق (Gelperin وآخرون.، 2005 تومالا وكورونا ، 2013 تومالا وآخرون.، 2014). من المهم قياس حدود تعبير البروتين بدقة للحصول على صورة واضحة لعواقب زيادة إفراز البروتين مما يؤدي إلى عيوب خلوية.

قضية أخرى هي تأكيد الفرضيات الموصوفة. إن عواقب الإفراط في التعبير عن البروتين معقدة لأن وظائف وخصائص البروتينات متنوعة ولكنها مترابطة. على سبيل المثال ، يتضمن الأشخاص النازحين داخليًا العديد من عوامل النسخ وإنزيمات البروتين. يمكن أن يتسبب الإفراط في التعبير عن هذه العوامل التنظيمية في حدوث تفاعلات مختلطة وتعديلات المسار. يمكن أن يتسبب الإفراط في التعبير عن عضو مركب بروتيني في تنشيط المسار وزيادة الحمل. مزيد من التحليل المنهجي لعلم وظائف الأعضاء الخلوي باستخدام تقنيات omics والطفرات الكابتة (كما هو الحال في تحليلات السلالات الذرية توريس وآخرون.، 2010). تحليلات التفاعل الجيني المنهجية (Sopko وآخرون.، 2006 دوغلاس وآخرون.، 2012) وتحليلات باستخدام بروتينات نموذجية (Geiler-Samerotte وآخرون.، 2011 Makanae وآخرون.، 2013 بارك وآخرون.، 2013 تومالا وآخرون.، 2014) في تشريح عواقب فرط التعبير عن البروتين. من الناحية المثالية ، يجب أن نجد مؤشرًا حيويًا أو مراسلًا مرتبطًا بكل آلية لتقييمها بشكل صحيح.


شاهد الفيديو: بنية البروتين. الأحياء. الجزيئات الضخمة (أغسطس 2022).