معلومة

لماذا عدد دورات PCR محدود؟

لماذا عدد دورات PCR محدود؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

قيل لي أن الحد الأقصى لعدد الدورات في تفاعل البوليميراز المتسلسل يتراوح بين 20 و 30.

هل هذا صحيح وما هي أسباب هذا القيد؟


أود أن أرسم الخط بعد 35 ، لكن هذا نوع من التجميل بعض الشيء. الأسباب عديدة:

  • نظرًا للأسلوب الأسي للتضخيم (بشكل مثالي) ، يتم استخدام الكواشف في مرحلة ما
  • الكواشف تتحلل ، وهذا ينطبق بشكل خاص على dNTPs
  • نشاط الإنزيم ، على الرغم من كونه مستقرًا للحرارة ، يتراجع بمرور الوقت
  • بعد 35 دورة ، يتم تسطيح المنحنى الأسي (الأسباب انظر أعلاه)
  • إذا قمت بتشغيل PCR لفترة طويلة جدًا ، فستحصل على المزيد والمزيد من المنتجات الجانبية (غالبًا ما تكون ثنائيات التمهيدي ، ولكن يمكن أيضًا أن تسبب البرايمر المحاذاة الخاطئة مشاكل) ، فهذه مشكلة بالنسبة لـ PCR في الوقت الفعلي أكثر من تلك التي يتم تشغيلها على هلام

إذا كنت بحاجة إلى حساسية أعلى مع المزيد من الدورات ، يمكنك استخدام التقنية المسماة "تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل". هناك تقوم بجولة أولى باستخدام زوج تمهيدي خاص بمنطقة الاهتمام ثم تقوم بجولة ثانية باستخدام البادئات الموجودة قليلاً داخل الحمض النووي المكبر. يتم ذلك لتجنب تضخيم التلوثات غير المرغوب فيها. نظرًا لأنك تقوم بحوالي 50-70 جولة من تضخيم PCR في المجموع ، فإن هذه الطريقة حساسة للغاية (أيضًا للتلوث). انظر الصورة من مقالة ويكيبيديا للحصول على التفاصيل:


كم عدد دورات PCR قبل نفاد dNTPs؟

افترض تفاعل 25 ميكرولتر.

افترض 200 ميكرومتر dNTPs.

200 ميكرومتر dNTPs = 200 ميكرولتر ميكرولتر -1

لذلك في رد فعل 25 ميكرولتر ، هناك 5000 pmol من dNTPs

= 5000 × 10-12 × 6 × 1023 الجزيئات

= 3 × 1015 جزيئات dNTP

افترض أننا نبدأ بجزيء واحد من قالب 1000 bp ، 50٪ GC

1 كيلو بايت = 2000 نيوكليوتيدات

إذن ، كم عدد هذه الجزيئات التي يمكننا بناؤها باستخدام 3 × 1015 جزيئات dNTP؟

= 3 × 1015/2000

= 1.5 × 1012 جزيئات الحمض النووي

كم عدد دورات PCR لإنتاج هذا العدد من جزيء قالب واحد؟

2ن = 1.5 × 1012

nlog2 = تسجيل (1.5) + تسجيل (1012)

nlog2 = 12.18

ن = 12.18 / سجل 2 = 41 دورة

بالطبع هذا في حد أقصى مطلق. يفترض التقدير أنك تبدأ بجزيء قالب واحد يبلغ 1 كيلو بايت ، وأن dNTPs لا تتحلل بالماء ، أو تتحلل بطريقة أخرى.


في بحثي الخاص ، وجدت أن كمية منتج PCR زادت مع زيادة الدورات إلى 50 مرة. كان هذا لزوج واحد من البادئات المستخدمة لتضخيم الحمض النووي الجيني المستخرج بمجموعة معينة كما لا ينطبق على التفاعلات الأخرى التي قمت بها. ما يبدو أن بعض الناس ينسونه هو أن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لا تتضاعف بالضرورة في كل دورة في أي نقطة في تفاعل البوليميراز المتسلسل لأن بعض البادئات لا تعمل بشكل جيد مثل البعض الآخر وقد تكون ظروف التفاعل دون المستوى الأمثل (على سبيل المثال ، وجود الملوثات أو تركيز أيونات ملغ).

باختصار ، شريطة ألا تحصل على منتجات ذات جودة منخفضة (مثل منتجات التلطيخ أو المنتجات الأولية غير المحددة) ، فأنا أعتقد أنه من الجيد زيادة عدد الدورات إلى ما بعد 30 - إنه شيء يجب عليك اختباره بشكل تجريبي باستخدام مواد أولية خاصة بك ، قالب ، بوليميراز ، عازلة إلخ.


تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو نسخة أنبوب اختبار من نفس عملية تكرار الحمض النووي الموجودة في الخلية الحية. إنها طريقة سريعة وغير مكلفة لتضخيم أو عمل نسخ عديدة من أجزاء صغيرة من الحمض النووي. يعد هذا ضروريًا لأن الطرق المستخدمة لتحليل الحمض النووي (تحديد تسلسل زوج قاعدة الحمض النووي) تتطلب مزيدًا من الحمض النووي أكثر مما قد يكون في عينة نموذجية. ميزة مفيدة بشكل خاص لـ PCR هي أنه يسمح لعملية التضخيم أن تقتصر على الأجزاء المستهدفة على وجه التحديد من خليط الحمض النووي - مثل علامات الكروموسوم Y المستخدمة في اختبار الأنساب.

عندما تصل قوارير خلايا الخد أو اللعاب إلى المختبر للاختبار ، يتم استخراج الحمض النووي وتنقيته. يتم خلطها أولاً بمنظف يتسبب في انفجار الخلايا وإطلاق حمضها النووي مع محتويات الخلايا الأخرى. يُغسل الخليط بعد ذلك بمحلول منظم يحتوي على فوسفات (ملح خفيف) لتخفيف الحطام الخلوي. مع الحد الأدنى من التحضير ، تكون العينة جاهزة ويمكن تضخيم الحمض النووي في المنطقة المستهدفة من الكروموسوم.


حول تلك الاختبارات RT-PCR

تستند قضيته بشكل أساسي إلى الاستخدام غير المناسب لاختبار RT-PCR. لقد وافق أحد زملائي بلطف على إعادة إنتاج تقييماته لهذا الاختبار - فهو ليس بمفرده. هات تيب جيري @ http://boomfinanceandeconomics.com/#/

تعد تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تقنية يصعب فهمها نظرًا لوجود العديد من الجوانب الدقيقة. كانت تقنية PCR موجودة منذ عام 1987 عندما اخترعها كاري موليس. حصل على جائزة نوبل لفعل ذلك. إنه ليس اختبارًا يطلبه الأطباء بسهولة. في الممارسة الطبية السريرية العادية ، يتم طلب ذلك فقط عند التعامل مع مرضى مصابين بمرض شديد. هناك حاجة إلى دراسة متأنية وتفسير دقيق للغاية والوضع السريري حرج.

يجب على الجميع مشاهدة مقاطع فيديو Kary Mullis على YouTube و Bitchute. لقد كان عبقريًا وعالمًا لامعًا لسوء الحظ ، فقد توفي مؤخرًا - قبل تفشي كوفيد مباشرة. https://www.bitchute.com/video/8KsH34IGgqBw/

اقتباس من كاري موليس ، الحائز على جائزة نوبل ومخترع اختبارات PCR:

"رجال مثل Fauci يصعدون هناك ويبدأون في الحديث ، كما تعلمون ، إنه لا يعرف أي شيء حقًا عن أي شيء وأود أن أقول ذلك في وجهه. لا شيئ. يعتقد الرجل أنه يمكنك أخذ عينة دم ووضعها في مجهر إلكتروني وإذا كان مصابًا بفيروس هناك فستعرف ذلك. إنه لا يفهم المجهر الإلكتروني ولا يفهم الطب ولا ينبغي أن يكون في وضع مثله. معظم هؤلاء الرجال الموجودين في الأعلى هم مجرد أشخاص إداريون ولا يعرفون شيئًا عما يحدث في الجسم.

كما تعلمون ، هؤلاء الرجال لديهم أجندة ، وهذا ليس ما نود أن يكون لدينا هو أننا ندفع لهم مقابل الاعتناء بصحتنا بطريقة ما. لديهم نوع شخصي من الأجندة. إنهم يشكلون قواعدهم الخاصة أثناء ذهابهم. يغيرونها عندما يريدون ذلك. وهم متعجرفون ، مثل توني فوسي لا يمانع في الظهور على شاشة التلفزيون أمام الأشخاص الذين يدفعون راتبه ويستلقون مباشرة أمام الكاميرا ".

يمكن أن يكون لعدد دورات PCR عواقب وخيمة.

هذا هو لب المشكلة بالرغم من وجود العديد والعديد من العوامل. لا يمكن لاختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل التمييز بين الكائنات الحية الدقيقة الحية (القابلة للحياة) والكائنات الميتة. كلاهما يحتوي على مادة وراثية. هذا هو السبب في أن استخدام اختبارات PCR مع أرقام Ct عالية (Amplification Cycle Numbers) في حالة الفحص أمر سخيف. لا ينبغي أبدًا استخدامه في الأشخاص الذين لا يعانون من أعراض "لتشخيص" المرض.

بسبب هذه المشكلة ، لا يمكن اعتباره "اختبارًا تشخيصيًا" بحتًا. لا يوجد أطباء يستحقون ملحهم سوف يعتبرون اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قائم بذاته تشخيصيًا. لدينا أكثر من 20 عامًا من الخبرة السريرية في هذه التكنولوجيا. إذا قمت بأكثر من 30 دورة تضخيم ، فيضمن لك العثور على بقايا أو ملوثات فيروسية غير قابلة للحياة (ميتة). قامت العديد من الدول بعمل 40-45 دورة خلال ظاهرة كوفيد. رقم الدورة مضمون لإنتاج معدل مرتفع من الاختبارات الإيجابية التي هي في الواقع خاطئة. نطلق عليها "الإيجابيات الكاذبة" في عالم الطب السريري.

اختبار إيجابي لـ SARS CoV2 (بأقل من 25 دورة تضخيم) مدموج مع يمكن أن يكون المريض الذي تظهر عليه أعراض الفيروس الحادة والتصوير المقطعي المحوسب الذي يظهر عتامة الزجاج الأرضي (خاصة على المستوى الثنائي) بالإضافة إلى النتائج الدموية للهجوم الفيروسي الحاد جزءًا من الدليل على التشخيص الأولي (المؤقت) لـ Covid 19. إذا كان يتقدم المسار السريري للمرض كما يتوقع المرء ، ومن ثم يمكن أن يصبح هذا التشخيص أكثر ثباتًا بمرور الوقت.

هذه هي الطريقة التي يمارس بها الطب السريري. إن "علماء الأوبئة" و "المستشارين الطبيين" للموظفين العموميين لحكوماتنا هم تقريبًا من غير الأطباء. أنهم أبدا رؤية مريض مريض. أنهم أبدا تحمل مسؤولية علاج شخص واحد مريض بشكل خطير بـ Covid 19. قد يصابون بالصدمة عندما يعلمون أن الأطباء يتجاهلونهم عمومًا ويعالجون مرضاهم بالزنك والمنشطات (سواء المستنشقة أو عن طريق الفم أو الرابع) وفيتامين د وإيفرمكتين و هيدروكسي كلوروكوين قبل تعود نتيجة اختبار PCR.

يُحدث التشخيص الجزيئي ثورة في الممارسة السريرية للأمراض المعدية. يمكن أن تكون آثارها كبيرة في أماكن الرعاية الحادة حيث تكون أدوات التشخيص الدقيقة في الوقت المناسب ضرورية لقرارات ونتائج علاج المريض. إعدادات الرعاية الحادة ليست فحصًا عامًا للسكان لعدم ظهور الأعراض. ولا يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل هو الاختبار أو الملاحظة الوحيدة التي سيستخدمها الطبيب في رعاية الحالات الحادة.

مع تطور أدوات تشخيص البيولوجيا الجزيئية الجديدة (PCR) ، ظهرت أسئلة صعبة بشأن دور هذا الاختبار في تقييم الأمراض المعدية السريرية. مع استمرار تدفق التشخيص الجزيئي من مقاعد البدلاء إلى السرير ، يجب أن يكتسب الأطباء معرفة عملية بالمبادئ والقيمة التشخيصية وقيود المقايسات المتنوعة في الإعدادات القائمة على المستشفى.

الأسلوب يعتمد على المعرفة على الأقل التسلسلات الجزئية من الحمض النووي المستهدف مسبقًا واستخدامها لتصميم بادئات قليلة النوكليوتيد التي تهجين على وجه التحديد إلى التسلسل المستهدف. التسلسل الجزئي ليس تسلسلاً كاملاً ، فهذه مشكلة محتملة لتفسير نتائج الاختبار.

من خلال دورات متعددة من التسخين والتبريد في جهاز تدوير حراري لإنتاج جولات من تمسخ الحمض النووي المستهدف ، وتهجين التمهيدي ، وتمديد التمهيدي ، يتم تضخيم الحمض النووي الهدف أضعافا مضاعفة“.

من الناحية النظرية ، فإن هذه الطريقة لديها القدرة على توليد مليارات النسخ من الحمض النووي المستهدف من نسخة واحدة في أقل من ساعة واحدة. وهكذا ، أ صغير الحجم يمكن العثور على جزء من مادة وراثية ميتة (غير قابلة للحياة) من خلال منهجية تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. لذلك عليك توخي الحذر الشديد بشأن النتائج. إنهم لا يمثلون "قضايا" إلا على BBC و ABC و CNN وآخرون.

حدود PCR:

تشمل أوجه القصور الرئيسية في تطبيق اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل على الإعداد السريري ما يلي:

  • النتائج الإيجابية الكاذبة من تلوث الخلفية بالحمض النووي
  • احتمالية نتائج الاختبار السلبية الكاذبة
  • حساسية الكشف تتجاوز الأهمية السريرية
  • مساحة كشف محدودة للمقايسة أو النظام الأساسي لتحديد الأنواع المتعددة أو عوامل الفوعة أو مقاومة الأدوية في وقت واحد.

ايجابيات مزيفة:

يمكن إعاقة الاستخدام الواسع النطاق لـ PCR في البيئات السريرية إلى حد كبير بسبب تلوث الخلفية من المصادر الخارجية للحمض النووي. في معظم المقايسات الخاصة بالعوامل الممرضة ، يتم اشتقاق المصدر السائد للتلوث من المنتجات "المرحلة" من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل السابقة التي يمكن إيواؤها ونقلها من خلال كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والأنابيب ، والماصات ، وأسطح المختبرات. إلى جانب قوة التضخيم القوية لـ PCR ، حتى الكميات الصغيرة جدًا من التلوث المرحل قد تكون بمثابة ركائز للتضخيم وتؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة.

يمكن لتدابير التحكم الدقيقة مثل الممارسات المختبرية الجيدة والفصل المادي لمناطق التضخيم المسبق وما بعد التضخيم أن تقلل من مخاطر التلوث ولكنها ليست مقاومة للخداع. يمكن أن يؤدي استخدام التثبيط الإنزيمي للحمض النووي المرحل (أي uracil N-glycosylase) إلى تقليل مخاطر التلوث.

بالنسبة لأطباء الرعاية الحادة في الخطوط الأمامية ، أو الأطباء العاملين في حالات الكوارث ، يمكن أن يسمح اختبار PCR شامل سريع ، أو لوحات من اختبارات PCR التي تستهدف فئات من مسببات الأمراض المتضمنة في متلازمات معينة مثل التهاب السحايا أو الالتهاب الرئوي أو الإنتان ، بالفرز السريع والمبكر العلاج الموجه العدواني.

لا يتم اتباع هذه النصيحة بسبب القلق المشروع فيما يتعلق بانتقال المرض من الحالات التي لا تظهر فيها أعراض أو التي لا تظهر عليها. ونتيجة لذلك ، فإن الوفرة الكبيرة للاختبارات هي الفحص وليس التشخيص.

تتمثل إحدى طرق تقليل النتائج الإيجابية الخاطئة في تكرار الاختبار باستخدام اختبار بتنسيق مختلف (جهة تصنيع مختلفة). نظرًا لمرافق الاختبار المحدودة ، لا يتم إجراء التأكيد بشكل روتيني ويتم تأكيد عدد قليل فقط من الإيجابيات من خلال اختبار rRT-PCR الثاني. من المحتمل أنه في انتشار المرض النشط الحالي ، فإن النتائج الإيجابية rRT-PCR للعديد من الأشخاص الذين لا تظهر عليهم أعراض هي نتائج إيجابية خاطئة. نحن نعلم بالفعل أن الرقم 90٪ على الأقل وقد يصل إلى 99٪ ، خاصة إذا كان رقم Ct يتجاوز 40.


إذا كان الاثنان متساويين أو شبه متساويين.)

عدد جزيئات التمهيدي الحرة في العينة أ بعد الدورة 4.

عدد جزيئات التمهيدي الحرة في العينة أ بعد الدورة 10.

عدد جزيئات التمهيدي الحرة في العينة أ بعد الدورة 10.

عدد جزيئات التمهيدي الحرة في العينة ب بعد الدورة 10.

عدد جزيئات مسبار TaqMan المجانية في العينة أ بعد الدورة 10.

عدد جزيئات مسبار TaqMan المجانية في العينة ب بعد الدورة 10.

عدد جزيئات مسبار TaqMan المجانية في العينة أ بعد الدورة 18.

العدد r لجزيئات مسبار TaqMan المجانية في العينة ب بعد الدورة 18.

عدد مجمعات صبغ المراسل / أحادي النوكليوتيد في العينة أ بعد الدورة 18.

عدد مجمعات صبغ المراسل / أحادي النوكليوتيد في العينة ب بعد الدورة 18.

عدد تضخيم HER2 شظايا في العينة أ بعد الدورة 20.

عدد تضخيم HER2 شظايا في العينة ب بعد الدورة 20.

عدد تضخيم HER2 شظايا في العينة أ بعد الدورة 30.

عدد تضخيم HER2 شظايا في العينة ب بعد الدورة 30.


حول تلك الاختبارات RT-PCR

راينر فويلميتش على وشك بدء الإجراءات القانونية ضد مرتكبي عملية احتيال Covid-19: كوفيد-غش-محامين-أطباء-خبراء-بدء-إجراءات-قانونية-ضد منظمة الصحة العالمية تستند قضيته بشكل أساسي إلى الاستخدام غير المناسب لاختبار RT-PCR. لقد وافق أحد زملائي بلطف على إعادة إنتاج تقييماته لهذا الاختبار - فهو ليس بمفرده. هات تيب جيري @ http://boomfinanceandeconomics.com/#/

تعد تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تقنية يصعب فهمها نظرًا لوجود العديد من الجوانب الدقيقة. كانت تقنية PCR موجودة منذ عام 1987 عندما اخترعها كاري موليس. حصل على جائزة نوبل لفعل ذلك. إنه ليس اختبارًا يطلبه الأطباء بسهولة. في الممارسة الطبية السريرية العادية ، يتم طلب ذلك فقط عند التعامل مع مرضى مصابين بمرض شديد. هناك حاجة إلى دراسة متأنية وتفسير دقيق للغاية والوضع السريري حرج.

يجب على الجميع مشاهدة مقاطع فيديو Kary Mullis على YouTube و Bitchute. لقد كان عبقريًا وعالمًا لامعًا لسوء الحظ ، فقد توفي مؤخرًا - قبل تفشي كوفيد مباشرة. https://www.bitchute.com/video/8KsH34IGgqBw/

اقتباس من كاري موليس ، الحائز على جائزة نوبل ومخترع اختبارات PCR: "رجال مثل Fauci ينهضون هناك ويبدأون في الحديث ، كما تعلمون ، إنه لا يعرف أي شيء حقًا عن أي شيء وأود أن أقول ذلك في وجهه. لا شيئ. يعتقد الرجل أنه يمكنك أخذ عينة دم ووضعها في مجهر إلكتروني وإذا كان مصابًا بفيروس هناك فستعرف ذلك. إنه لا يفهم المجهر الإلكتروني ولا يفهم الطب ولا ينبغي أن يكون في وضع مثله. معظم هؤلاء الرجال الموجودين في الأعلى هم مجرد أشخاص إداريون ولا يعرفون شيئًا عما يحدث في الجسم. كما تعلمون ، هؤلاء الرجال لديهم أجندة ، وهذا ليس ما نود أن يكون عليه الأمر الذي ندفعه لهم للاعتناء بصحتنا بطريقة ما. لديهم نوع شخصي من الأجندة. إنهم يشكلون قواعدهم الخاصة أثناء ذهابهم. يغيرونها عندما يريدون ذلك. وهم متعجرفون ، مثل توني فوسي لا يمانع في الظهور على شاشة التلفزيون أمام الأشخاص الذين يدفعون راتبه ويستلقون مباشرة أمام الكاميرا ".

يمكن أن يكون لعدد دورات PCR عواقب وخيمة. هذا هو لب المشكلة بالرغم من وجود العديد والعديد من العوامل. لا يمكن لاختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل التمييز بين الكائنات الحية الدقيقة الحية (القابلة للحياة) والكائنات الميتة. كلاهما يحتوي على مادة وراثية. هذا هو السبب في أن استخدام اختبارات PCR مع أرقام Ct عالية (Amplification Cycle Numbers) في حالة الفحص أمر سخيف. لا ينبغي أبدًا استخدامه في الأشخاص الذين لا يعانون من أعراض "لتشخيص" المرض.

بسبب هذه المشكلة ، لا يمكن اعتباره "اختبارًا تشخيصيًا" بحتًا. لا يوجد أطباء يستحقون ملحهم سوف يعتبرون اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قائم بذاته تشخيصيًا. لدينا أكثر من 20 عامًا من الخبرة السريرية في هذه التكنولوجيا. إذا قمت بأكثر من 30 دورة تضخيم ، فيضمن لك العثور على بقايا أو ملوثات فيروسية غير قابلة للحياة (ميتة). قامت العديد من الدول بعمل 40-45 دورة خلال ظاهرة كوفيد. رقم الدورة مضمون لإنتاج معدل مرتفع من الاختبارات الإيجابية التي هي في الواقع خاطئة. نطلق عليها "الإيجابيات الكاذبة" في عالم الطب السريري.

اختبار إيجابي لـ SARS CoV2 (مع أقل من 25 دورة تضخيم) مدموج مع يمكن أن يكون المريض الذي تظهر عليه أعراض الفيروس الحادة والتصوير المقطعي المحوسب الذي يظهر عتامة الزجاج الأرضي (خاصة على المستوى الثنائي) بالإضافة إلى النتائج الدموية للهجوم الفيروسي الحاد جزءًا من الدليل على التشخيص الأولي (المؤقت) لـ Covid 19. إذا كان يتقدم المسار السريري للمرض كما يتوقع المرء ، ومن ثم يمكن أن يصبح هذا التشخيص أكثر ثباتًا بمرور الوقت.

هذه هي الطريقة التي يمارس بها الطب السريري. إن "علماء الأوبئة" و "المستشارين الطبيين" للموظفين العموميين لحكوماتنا هم تقريبًا من غير الأطباء. أنهم أبدا رؤية مريض مريض. أنهم أبدا تحمل مسؤولية علاج شخص واحد مريض بشكل خطير بـ Covid 19. قد يصابون بالصدمة عندما يعلمون أن الأطباء يتجاهلونهم عمومًا ويعالجون مرضاهم بالزنك والمنشطات (سواء المستنشقة أو عن طريق الفم أو الرابع) وفيتامين د وإيفرمكتين و هيدروكسي كلوروكوين قبل تعود نتيجة اختبار PCR.

يُحدث التشخيص الجزيئي ثورة في الممارسة السريرية للأمراض المعدية. يمكن أن تكون آثارها كبيرة في أماكن الرعاية الحادة حيث تكون أدوات التشخيص الدقيقة في الوقت المناسب ضرورية لقرارات ونتائج علاج المريض. إعدادات الرعاية الحادة ليست فحصًا عامًا للسكان لعدم ظهور الأعراض. ولا يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل هو الاختبار أو الملاحظة الوحيدة التي سيستخدمها الطبيب في رعاية الحالات الحادة.

مع تطور أدوات تشخيص البيولوجيا الجزيئية الجديدة (PCR) ، نشأت أسئلة صعبة بشأن دور هذا الاختبار في تقييم الأمراض المعدية السريرية. مع استمرار تدفق التشخيص الجزيئي من مقاعد البدلاء إلى السرير ، يجب أن يكتسب الأطباء معرفة عملية بالمبادئ والقيمة التشخيصية وقيود المقايسات المتنوعة في الإعدادات القائمة على المستشفى.

الأسلوب يعتمد على المعرفة على الأقل التسلسلات الجزئية من الحمض النووي المستهدف مسبقًا واستخدامها لتصميم بادئات قليلة النوكليوتيد التي تهجين على وجه التحديد إلى التسلسل المستهدف. التسلسل الجزئي ليس تسلسلاً كاملاً ، فهذه مشكلة محتملة لتفسير نتائج الاختبار.

من خلال دورات متعددة من التسخين والتبريد في جهاز تدوير حراري لإنتاج جولات من تمسخ الحمض النووي المستهدف ، وتهجين التمهيدي ، وتمديد التمهيدي ، يتم تضخيم الحمض النووي الهدف أضعافا مضاعفة“.

من الناحية النظرية ، فإن هذه الطريقة لديها القدرة على توليد مليارات النسخ من الحمض النووي المستهدف من نسخة واحدة في أقل من ساعة واحدة. وهكذا ، أ صغير الحجم يمكن العثور على جزء من مادة وراثية ميتة (غير قابلة للحياة) من خلال منهجية تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. لذلك عليك توخي الحذر الشديد بشأن النتائج. إنهم لا يمثلون "قضايا" إلا على BBC و ABC و CNN وآخرون.

حدود PCR: تشمل أوجه القصور الرئيسية في تطبيق اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل على الإعداد السريري ما يلي:

  • النتائج الإيجابية الكاذبة من تلوث الخلفية بالحمض النووي
  • احتمالية نتائج الاختبار السلبية الكاذبة
  • حساسية الكشف تتجاوز الأهمية السريرية
  • مساحة كشف محدودة للمقايسة أو النظام الأساسي لتحديد الأنواع المتعددة أو عوامل الفوعة أو مقاومة الأدوية في وقت واحد.

ايجابيات مزيفة: يمكن إعاقة الاستخدام الواسع النطاق لـ PCR في البيئات السريرية إلى حد كبير بسبب تلوث الخلفية من المصادر الخارجية للحمض النووي. في معظم المقايسات الخاصة بالعوامل الممرضة ، يتم اشتقاق المصدر السائد للتلوث من المنتجات "المرحلة" من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل السابقة التي يمكن إيواؤها ونقلها من خلال كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والأنابيب ، والماصات ، وأسطح المختبرات. إلى جانب قوة التضخيم القوية لـ PCR ، حتى الكميات الصغيرة جدًا من التلوث المرحل قد تكون بمثابة ركائز للتضخيم وتؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة.


لماذا عدد دورات PCR محدود؟ - مادة الاحياء

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

PCR بمزيج يحتوي على أ dsDNA نموذج ، زوج من قصيرة بادئات قليلة النوكليوتيد ssDNA ، مجموعة من الأربعة dNTPs ، وأ بوليميراز DNA المقاوم للحرارة, طق إنزيم . يتم تنفيذ التفاعل في كتلة التدفئة التي ينظمها الكمبيوتر، أ جهاز تدوير حراري ، والذي يسمح بالتدفئة والتبريد السريع والتحكم فيهما. ال الاشعال يتم اختيارها بحيث تكون مكملة للقاعدة للأطراف المتقابلة لأي من خيطي امتداد قصير من الحمض النووي الذي يحتوي على منطقة الجين ذات الأهمية: PCR وبالتالي يتطلب بعض المعرفة المسبقة للجين.

يسخن التفاعل أولاً إلى 95 درجة مئوية لتذوب (تفسد) ال dsDNA إلى خيوط منفصلة. ثم يبرد التفاعل إلى

50 درجة مئوية، حيث درجة الحرارة الاشعال سوف تجد المناطق التكميلية الأساسية في ssDNA، والتي سوف يلتزمون بها (يصلب). يسخن التفاعل أخيرًا إلى 72 درجة مئوية، حيث درجة الحرارة طق الانزيم يكرر معبي ssDNA (تمديد). في نهاية دورة واحدة ، تم نسخ المنطقة بين البادئين مرة واحدة ، مما ينتج نسختين من منطقة الجين الأصلية. [هذا مبالغة في التبسيط قليلاً: انظر تفاصيل].

نظرًا لاستخدام بوليميراز مقاوم للحرارة ، يمكن تكرار التفاعل بشكل مستمر دون إضافة المزيد من الإنزيم. كل دورة الزوجي عدد نسخ الجين المضخم: عشر دورات تنتج بشكل مثالي 2 4 8 16 32 64128255121024 (2 10) نسخة. هكذا، 30 دورة ينتج عنها (2 × 3) = 10 9 أضعاف التضخيم. ينتج عن ذلك كمية كافية من منطقة الجينات ذات الأهمية للتحليل المباشر ، على سبيل المثال بواسطة تسلسل الحمض النووي.


صبغة ربط الحمض النووي:

بالنسبة لشخص مبتدئ وعديم الخبرة ، فإن طريقة صبغ ربط الحمض النووي هي أفضل تقنية للكشف في الوقت الفعلي.

الصبغة لها مضان خاص بها. بمجرد ربط الصبغة بالحمض النووي مزدوج السلسلة ، يزيد التألق المنبعث من الصبغة بمقدار 100 إلى 1000 ضعف من الإشارة الأصلية.

ومع ذلك ، يؤخذ مضان الصبغة الأصلية كخط أساس للكشف.

الطريقة سريعة وسريعة وموثوقة وفعالة من حيث التكلفة. أيضًا ، تكون فرصة الخطأ في التجارب أقل ويكون إعداد التفاعل بسيطًا وسهل الاستخدام.

تعتمد نتيجة التجربة على خصوصية البادئات المستخدمة في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

لأنه على الرغم من أن البادئات مرتبطة بشكل غير محدد ، فإن صبغة ربط الحمض النووي ترتبط بالتسلسل غير المحدد وتعطي إشارات الفلورسنت.

نظرًا لأن الصبغة تكتشف الحمض النووي مزدوج الشريطة لربطه ، حتى إذا كان dsDNA غير محدد ، يجب أن ترتبط الصبغة به.

لذلك فإن فرصة الكشف غير المحدد عالية في طريقة SYBR القائمة على الصبغة الخضراء.

يعد SYBR green أحد أشهر الأصباغ المستخدمة في PCR في الوقت الفعلي.

حساسية التجربة محدودة. مرة أخرى يطرح سؤال في الاعتبار ،

هل هي مناسبة لتحديد القوالب الحساسة؟

يمكننا تحديد الارتباطات غير المحددة في التفاعل عن طريق إجراء تحليل منحنى الذوبان.

تحليل منحنى الذوبان:

بمجرد اكتمال تفاعل التضخيم وتسجيل إشارات التألق ، يتم صهر القالب لتحديد الارتباطات غير المحددة.

يتم صهر القالب باستخدام التسخين ، وتتفكك الصبغة ويتم تقليل إشارات التألق.

تم الإبلاغ عن الانتقال المنخفض لمجموعة واسعة من الفلورة لمنتج معين بينما تم تسجيل انتقال حرارة مختلف لنطاقات قصيرة مختلفة غير محددة.

"التسلسلات الأكبر تستغرق وقتًا أطول ودرجة حرارة أعلى للذوبان بينما تذوب العصابات غير المحددة عند درجة حرارة منخفضة ولها منحنيات درجة حرارة انصهار مختلفة."

تم رسم البيانات في الرسم البياني لدرجة حرارة الانصهار مقابل الأسفار أدناه.

يُطلق على الرسم البياني لدرجة حرارة الانصهار مقابل درجة حرارة الانصهار أيضًا منحنى التفكك وتسمى الطريقة تحليل منحنى التفكك.

صورة: تُظهر الصورة منحنى التفكك لمنتج معين وثنائيات التمهيدي بينما تُظهر صورة أخرى منحنيات تفكك مختلفة لاثنين من متماثل الزيجوت ومتغاير الزيجوت.

SYBR green و EvaGreen نوعان من الصبغات الرئيسية المستخدمة في PCR الكمي في الوقت الحقيقي. تُستخدم التجارب في التحقق من صحة المقايسات مثل المصفوفة الدقيقة للحمض النووي.

تستخدم كيمياء مسبار TaqMan على نطاق واسع في PCR الكمي ، واسم TaqMan مأخوذ من & # 8220Taq & # 8221 Taq DNA polymerase (لأن كيمياء المسبار تعتمد على نشاط Taq DNA polymerase) و & # 8220رجل & # 8221 من لعبة PacMan. نعم ، الاسم مأخوذ من اللعبة. تذكر ما تفعله PacMan؟


أنواع مختلفة من تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على أساس التدوير الحراري (خطوات التسخين والتبريد)

تستخدم تقنيات التدوير الحراري دورة درجة الحرارة لدفع الدورات المتكررة لتخليق الحمض النووي.

Multiplex PCR

Multiplex PCR هو نوع من تقنية PCR الذي يسمح بتضخيم العديد من المتواليات المستهدفة في نفس الوقت في نفس خليط التفاعل.

يتضمن خليط التفاعل الفردي مجموعات من أزواج التمهيدي لأهداف مختلفة من الحمض النووي. يقلل من استهلاك كواشف PCR، وفي الوقت نفسه ، يفرض قيودًا على المواد الأولية المستخدمة.

للعمل بشكل صحيح ضمن تفاعل واحد ، يجب تحسين مجموعات من البادئات. يجب أن يكون لديهم درجات حرارة صلبة متشابهة وأن ينتجوا أمبليكونات بأحجام مختلفة لتشكيل نطاقات رحلان كهربي متميزة لتحليل PCR المتبع.

متداخلة PCR

يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل لزيادة خصوصية تضخيم الحمض النووي لتقليل المنتجات غير المحددة.

تستخدم هذه التقنية مجموعتين من البادئات.

المجموعة الأولى تسمح بتفاعل البلمرة المتسلسل الأول. يعمل ناتج هذا التفاعل كمصدر للحمض النووي المستهدف إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني باستخدام المجموعة الثانية من البادئات.

بدء PCR سريعًا

يعمل هذا النوع من تفاعل البلمرة المتسلسل على تقليل التضخيم غير المحدد أثناء مراحل الإعداد الأولية.

تحافظ تقنية Hot-start PCR على بوليميراز الحمض النووي في حالة غير نشطة عند درجات حرارة أقل من درجة حرارة التلدين.

يمنع هذا التعديل التضخيم أثناء إعداد التفاعل عندما ترتبط البادئات بتسلسلات الحمض النووي ذات التماثل المنخفض.

نوعان مختلفان من هذه التقنية هما بدء التشغيل الساخن PCR ميكانيكيًا وغير ميكانيكي.

بدء التشغيل الميكانيكي الساخن PCR يتم إجراؤها عن طريق تسخين خليط التفاعل إلى درجة حرارة انصهار الحمض النووي قبل إضافة بوليميريز Taq.

بدء التشغيل الساخن غير الميكانيكي PCR يستخدم أنظمة إنزيمات متخصصة تمنع تنشيط بوليميراز الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة.

Touchdown PCR

Touchdown PCR هي تقنية أخرى لتقليل التضخيم غير المحدد.

يتم تحقيق ذلك عن طريق رفع درجة حرارة التلدين فوق درجة حرارة انصهار المواد الأولية المستخدمة في الدورات الأولية وخفضها في الدورات اللاحقة.

تساعد درجات الحرارة المرتفعة خلال الدورات الأولية الاشعال على الارتباط بقوالب الحمض النووي بخصوصية أكبر بينما تسمح درجات الحرارة المنخفضة بتضخيم أكثر كفاءة من الأمبليكون المنتجة.

تفاعل Ligase المتسلسل (LCR)

يستخدم هذا النوع من تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل أربعة بادئات لتضخيم الحمض النووي (اثنان من البادئات لكل خيط من هدف الحمض النووي).

تعتبر بادئات تفاعل Ligase المتسلسل أطول بكثير من بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل المعتادة ومصممة لتغطية التسلسل بأكمله ليتم تضخيمه.

أثناء خطوة التلدين الأولى ، يتم غلق البادئات بواسطة ليجاز DNA القابل للحرارة.

هذا يولد جزءًا بطول الطول الإجمالي لكل زوج من البادئات التي تعمل كقوالب DNA للدورات اللاحقة.

الميزة الرئيسية لتفاعل Ligase المتسلسل هي أن طفرة أحادية النقطة بالقرب من التقاطع في القالب الأصلي DNA يمكن أن تمنع التفاعل وغياب المنتج يمكن أن يكون مؤشرًا على الطفرات.

PCR الكمي (qPCR)

تعتمد كمية المنتج التي يتم تصنيعها خلال عدد محدد من دورات تفاعل البلمرة المتسلسل على عدد جزيئات الحمض النووي الموجودة في خليط البداية. يتيح ذلك استخدام PCR لتحديد عدد جزيئات الحمض النووي الموجودة في المستخلص.

في PCR الكمي ، تتم مقارنة كمية المنتج المركب أثناء اختبار PCR بالكميات التي تم تصنيعها أثناء PCRs مع الكميات المعروفة من بدء DNA.

الوقت الحقيقي PCR

اليوم ، يتم إجراء القياس الكمي بواسطة PCR في الوقت الفعلي - وهو تعديل لتقنية PCR القياسية التي يتم فيها قياس توليف المنتج بمرور الوقت.

في كثير من الأحيان يتم استخدام هذه الطريقة لقياس كميات الحمض النووي الريبي.

على سبيل المثال لتحديد التعبير عن جين معين في الخلايا السرطانية. تسمح هذه الطريقة بمراقبة تطور السرطان.

النسخ العكسي PCR

لتنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل حيث يكون الحمض النووي الريبي هو مادة البداية ، تستخدم هذه الطريقة النسخ العكسية ، وهي عملية تسمى RT – PCR (تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخة العكسية).

الخطوة الأولى في هذه الطريقة هي تحويل جزيئات الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي التكميلي أحادي السلسلة (كدنا). بعد هذه الخطوة ، تستمر التجربة كما هو الحال في التقنية القياسية.

بعض البوليميرات المقاومة للحرارة ، مثل Tth ، لها نشاط النسخ العكسي تحت ظروف عازلة معينة وقادرة على عمل نسخ DNA من كل من جزيئات RNA و DNA.

TaqMan PCR

TaqMan PCR هي واحدة من تقنيات PCR في الوقت الحقيقي.

يستخدم مسبار قليل النوكليوتيد وهو مكمل لتسلسل داخلي داخل الخيوط المضخمة.

لديها مجموعة الفلورسنت في أحد طرفيها وتروى في نهاية أخرى. طالما بقي كل من الفلوروفور والمخمر داخل مسبار قليل النوكليوتيد ، فلن ينبعث أي مضان.

أثناء تضخيم الحمض النووي ، سيرتبط مسبار قليل النوكليوتيد والبادئات بالخيوط المركبة حديثًا. سوف يدمر البوليميراز المسبار بسبب نشاط نوكلياز خارجي 5 → 3 ويطلق الفلوروفور.

تتناسب شدة التألق مع كمية المنتج المتولد.

تجميع PCR

تم تطوير تجميع PCR أو Polymerase Cycling Assembly لإنتاج تسلسلات حمض نووي طويلة جديدة.

يتمثل الاختلاف الرئيسي عن تفاعل البلمرة المتسلسل التقليدي في طول وكمية البادئات.

لتجميع قليل النوكليوتيد الاصطناعي ، يتم إجراء تجميع PCR على مواد أولية طويلة تصل إلى 50 نيوكليوتيد. تحتوي هذه البادئات على أجزاء متداخلة قصيرة وتتناوب بين الاتجاهين المعسسين والمضاد للمعنى الذي يغطي التسلسل المستهدف بأكمله.

خلال الدورات المتتالية ، يتم تهجين البادئات بواسطة مقاطع تكميلية ثم يزيد البوليميراز من طول الأجزاء لإنتاج تسلسل الحمض النووي الطويل النهائي.

عادةً ما يتبع مرحلة التجميع تفاعل سلسلة بوليميراز منتظم مع بادئات نهائية لزيادة كمية المنتج النهائي.


استكشاف أخطاء PCR وإصلاحها

ماذا يجب أن تفعل عندما يحدث خطأ في تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بك؟ يمكن أن تضعك الأسئلة الشائعة أدناه على طريق نحو PCR ناجح.

للحصول على نصائح حول كيفية إنقاذ تجاربك من تلوث PCR ، راجع مقالة المدونة هذه.

إذا لم يتم الحصول على منتجات تضخيم ، فما المعلمات التي يجب مراعاتها أولاً عند استكشاف الأخطاء وإصلاحها؟

ضع في اعتبارك ما يلي:

  • أولاً ، تأكد من تضمين جميع مكونات PCR في التفاعلات. يجب دائمًا تضمين عنصر تحكم إيجابي لضمان وجود كل مكون وعمله.
  • إذا لم تكن هناك مشاكل في الإعداد التجريبي ، فقم بزيادة عدد دورات PCR (3 & ndash5 دورات في كل مرة) ، حتى 40 دورة. يمكن أن تؤدي زيادة رقم الدورة إلى التغلب على المشكلات المتعلقة بقالب الوفرة المنخفضة أو عدم إمكانية الوصول إلى القالب بسبب الشوائب أو ضعف كفاءة التحضير في البادئات.
  • إذا لم تؤدي زيادة رقم الدورة إلى تحسين النتائج ، فقد تكون شروط PCR صارمة للغاية بالنسبة لمجموعة أو قالب التمهيدي المعين. ضع في اعتبارك تعديل شروط PCR على النحو التالي:
    • اخفض درجة حرارة التلدين بزيادات قدرها 2 درجة.
    • زيادة وقت التمديد.
    • قم بزيادة مبلغ القالب. ارجع إلى الإرشادات المتوفرة مع الإنزيم لتحديد المقدار الأمثل للقالب.

    ضع في اعتبارك هذه الأسباب المحتملة الإضافية لفشل تفاعل البوليميراز المتسلسل:

    • مثبطات PCR في نموذج النموذج
      في حالة وجود مثبطات PCR ، فإن استخدام القالب المخفف قد يزيد من كفاءة PCR. بدلاً من ذلك ، قد يحتاج القالب إلى التنقية باستخدام مجموعة مثل NucleoSpin Gel و PCR Clean-up kit. إذا لم يكن تنقية القالب أمرًا محتملاً ، فقد يؤدي الإنزيم الذي يتمتع بقدرة أعلى على تحمل الشوائب ، مثل Terra PCR Direct polymerase ، إلى تحسين النتائج.
    • يحتوي القالب على & gt65٪ محتوى GC
      عند التضخيم من قوالب ذات محتوى عالٍ من GC ، استخدم إنزيمًا تمت صياغته لهذه الحالة. قم بزيارة دليل اختيار تفاعل البوليميراز المتسلسل للعثور على الإنزيم المناسب.
    • الاشعال ليس هو الأمثل
      تحقق من البرايمر وأعد تصميمه بعناية إذا لزم الأمر. ضع في اعتبارك أيضًا إعادة تضخيم منتج PCR الأساسي باستخدام تخفيفات بمقدار 10 أضعاف (1: 100 إلى 1: 10000) باستخدام بادئات متداخلة.

    عند استخدام PrimeSTAR HS DNA Polymerase ، ضع في اعتبارك:

    • استخدام كمية مناسبة من القالب. إذا كان القالب عبارة عن DNA جيني بشري أو مكتبة cDNA ، فلا تستخدم أكثر من

    عند استخدام PrimeSTAR Max DNA Polymerase ، ضع في اعتبارك:

    • ضبط وقت التمديد إذا كان خليط التفاعل يحتوي على قالب زائد. إذا تجاوزت كمية القالب 200 نانوغرام في خليط تفاعل 50- وميكروول ، فاضبط وقت التمديد بين 30 ثانية / كيلو بايت و 1 دقيقة / كيلو بايت.
    • زيادة تركيز البادئات.

    عند استخدام SpeedSTAR HS DNA Polymerase ، ضع في اعتبارك:

    • زيادة وقت التمديد. على الرغم من أن وقت التمديد القياسي هو 10 ثوانٍ / كيلو بايت ، إلا أنه يمكن زيادة وقت التمديد إلى

    إذا كانت هناك نطاقات تضخيم غير محددة ، فما الذي يمكن فعله لتحسين الخصوصية؟

    جميع بوليمرات Takara Bio PCR

    مشكلة:

    حل:

    استخدم محاذاة بلاست لتحديد ما إذا كانت الأطراف الثلاثة للبادئات مكملة لمواقع أخرى غير الموقع (المواقع) المستهدفة. أعد تصميم البادئات إذا لزم الأمر أو قم بتعديل شروط PCR.

    مشكلة:

    شروط PCR ليست صارمة بما فيه الكفاية.

    حلول:

    • زيادة درجة حرارة التلدين بزيادات قدرها 2 درجة.
    • استخدام اللمس PCR.
    • استخدم بروتوكول PCR من خطوتين.
    • تقليل عدد دورات PCR.

    مشكلة:

    تم استخدام قالب أكثر من اللازم.

    حل:

    قلل الكمية بمقدار 2 و ndash5 أضعاف.

    PrimeSTAR HS و PrimeSTAR Max DNA polymerases

    مشكلة:

    وقت التلدين طويل جدا.

    حل:

    لتحقيق تضخيم محدد ، من الضروري استخدام وقت تلدين قصير (5 & ndash15 ثانية) عند إجراء PCR من ثلاث خطوات.

    PrimeSTAR GXL DNA polymerases

    مشكلة:

    الاشعال لها T دون المستوى الأمثلم القيم.

    حل:

    لتضخيم الأهداف & lt1 kb ، صمم البادئات باستخدام T.م القيم & gt55 & degC ، واستخدام درجة حرارة التلدين 60 درجة مئوية. إذا كان التمهيدي T.م القيم هي & lt55 & degC ، جرب وقت تمديد أقصر يتراوح بين 5 و 10 ثوانٍ / كيلو بايت.

    تاكارا السابق طق وتاكارا لا طق بوليميرات الحمض النووي

    مشكلة:

    التمهيدي غير محدد التلدين في درجات حرارة منخفضة.

    حل:

    قد تعمل إصدارات البدء السريع من هذه الإنزيمات على تحسين النتائج لبعض البادئات.

    SpeedSTAR HS DNA Polymerase

    مشكلة:

    تلطيخ نطاقات منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل على مادة هلامية.

    حل:

    قد تؤدي فترات التمديد الطويلة للغاية إلى تلطيخ. التوصية العامة لتمديد الوقت لهذا الإنزيم هي 10 & ndash20 ثانية / كيلو بايت. إذا كان عائد PCR منخفضًا ، فحاول زيادة عدد الدورات بمقدار 5.

    إذا كان تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يولد مسحة بعد وضع المنتجات على مادة هلامية ، فما الذي يمكن فعله لتحسين النتائج؟

    أولاً ، حدد مصدر اللطاخة باستخدام عناصر تحكم موجبة وسلبية (بدون قالب). يمكن أن يحدد هذا ما إذا كان سبب اللطاخة هو التلوث أو التدوير الزائد ، أو إذا كانت اللطاخة ناتجة عن مواد أولية سيئة التصميم أو ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) دون المستوى الأمثل.

    إذا كان عنصر التحكم السلبي فارغًا ، فلا يوجد تلوث. بدلاً من ذلك ، يجب تحسين شروط PCR مراعاة ما يلي عند ضبط شروط PCR:

    • تقليل حجم القالب.
    • زيادة درجة حرارة التلدين.
    • استخدام اللمس PCR.
    • تقليل عدد دورات PCR.
    • إعادة تصميم البرايمر.
    • استخدم مواد أولية متداخلة.
    • أعد تضخيم المنتج. (يمكن إزالة سدادة صغيرة من الجل باستخدام طرف الماصة الدقيقة ، ويمكن استعادة الحمض النووي عن طريق إضافة السدادة إلى 200 وماكرول من الماء ثم الحضانة عند 37 درجة مئوية. 5 & ميكرول من هذا المحلول يمكن استخدامه كقالب PCR لإعادة تضخيم.)

    إذا تم تلطيخ التحكم السلبي أيضًا ، فهناك تلوث. سوف تحتاج إلى تحديد مصدر هذا التلوث. قد يكون من الضروري استبدال كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل وتطهير الماصات ومحطة العمل الخاصة بك (انظر الأسئلة أدناه للحصول على مزيد من المعلومات حول التلوث).

    ما هي بعض مصادر تلوث تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

    هناك أربعة مصادر رئيسية لتلوث تفاعل البوليميراز المتسلسل:

    1. المصدر الأكثر شيوعًا للتلوث هو منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من التضخمات السابقة (يُطلق عليه "التلوث المرحل"). عندما يتم إنشاء كميات كبيرة من منتج PCR (10 12 جزيء) بشكل متكرر على مدى فترة من الزمن ، تزداد احتمالية التلوث.
    2. مصدر آخر للتلوث هو الحمض النووي المستنسخ الذي تم تداوله سابقًا في المختبر.
    3. يمكن أن يحدث تلوث من عينة إلى عينة أيضًا. من المرجح العثور على مصدر التلوث هذا في العينات التي تتطلب معالجة مكثفة قبل التضخيم.
    4. يمكن أن تتلوث التفاعلات أيضًا بالحمض النووي الخارجي في البيئة ، بما في ذلك الحمض النووي الموجود في معدات المختبرات وفي الكواشف المستخدمة لاستخراج الحمض النووي و PCR.

    كيف يمكن تجنب التلوث؟

    تتطلب حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل عدم تلوث العينات بأي حمض نووي خارجي أو أي منتجات تم تضخيمها سابقًا من بيئة المختبر. نوصي باستخدام مناطق متميزة لتحضير العينة وإعداد PCR وتحليل ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل.

    يوصى بخزانة التدفق الرقائقي المجهزة بمصباح UV لتحضير خلائط التفاعل.يجب إنشاء محطتين منفصلتين ماديًا عن بعضهما البعض.

    • قم بإنشاء "منطقة ما قبل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل" المخصصة لإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل فقط. يجب عدم إدخال أي عناصر من "منطقة ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل" في هذه المنطقة ، بما في ذلك عناصر مثل أجهزة الكمبيوتر المحمولة والأقلام.
    • إنشاء "منطقة ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل" التي تُستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتنقية الحمض النووي المضخم لـ PCR ، وقياس تركيز الحمض النووي ، وتشغيل المواد الهلامية agarose ، وتحليل منتجات PCR.

    يجب أيضًا أن تقتصر المعدات على هذه المناطق. يجب وضع جهاز PCR وجهاز التفريد في منطقة ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل. يوصى بشدة باستخدام الماصات وأطراف الماصات المزودة بمرشحات الهباء الجوي المخصصة لعينة الحمض النووي وإعداد خليط التفاعل فقط. تشمل التوصيات الإضافية ما يلي:

    • وجود مجموعات منفصلة من الماصات وأطراف الماصات ، ومعاطف المختبر ، وصناديق القفازات ، وسلال النفايات لمناطق ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل وما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    • وضع ملصقات على عناصر ما قبل وما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، بحيث لا تتم إزالتها من منطقة العمل المخصصة لها.
    • باتباع القاعدة الذهبية لـ PCR: لا تجلب أبدًا أي كواشف أو معدات أو ماصات مستخدمة في منطقة ما بعد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    • تحضير وتخزين كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل منفصل واستخدامها فقط للغرض المخصص لها. يجب تقسيم الكواشف في أجزاء صغيرة وتخزينها في مناطق معينة اعتمادًا على ما إذا كانت تستخدم في تطبيقات ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل. يجب تخزين القسامات بشكل منفصل عن عينات الحمض النووي الأخرى.

    يجب دائمًا إجراء تفاعل تحكم يحذف قالب الحمض النووي لتأكيد عدم وجود تلوث. بالإضافة إلى ذلك ، يجب الإبقاء على عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى الحد الأدنى ، لأن المقايسات شديدة الحساسية تكون أكثر عرضة لتأثيرات التلوث.

    كيف يمكنني إزالة التلوث إذا كنت مصابًا بتلوث تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

    1. اترك الماصات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. يشجع التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية الارتباط المتقاطع لبقايا الثيميدين ، مما يؤدي إلى إتلاف الحمض النووي المتبقي.
    2. رش محطات العمل / المعدات / الماصات بنسبة 10٪ مبيض ثم امسحها نظيفة.
    3. تقوم محطات العمل المتغيرة بنقل منطقة ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى موقع آخر تم تنظيفه مسبقًا.
    4. لا تستخدم أي أدوات أو ماصات استخدمتها من قبل.

    ماذا يمكنني أن أفعل إذا كان PCR يولد أخطاء؟

    لتجنب الأخطاء أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، نوصي باستخدام إنزيم عالي الدقة (انظر دليل الاختيار). بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من تجنب ما يلي:

    1. الإفراط في التدوير
      تجاوز تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل غالبًا:
      • يغير الرقم الهيدروجيني للتفاعل بطريقة تزعزع استقرار الحمض النووي.
      • يزيد من كمية منتج PCR ، وبالتالي يقلل من كفاءة البوليميراز ويعزز الأخطاء.
      • يقلل من كمية dNTPs ، وبالتالي يزيد من احتمالية سوء الدمج الأساسي بسبب تركيز dNTP غير المتوازن. (في حالة استخدام إنزيمات PCR من Takara Bio ، يتم تحسين تركيز dNTP إلى 200 نانومتر ، مما يؤدي إلى زيادة تركيز dNTP إلى التلاعب.)
      • يتسبب في تراكم الحمض النووي أحادي الجديلة ومزدوج الجديلة.
    2. تركيز عال ملغ 2+
      يتراوح تركيز Mg 2+ من 1 و ndash5 ملم. قد يؤدي استخدام تركيز عالي من Mg 2+ إلى زيادة العائد ، ولكنه قد يؤثر أيضًا على نشاط التدقيق اللغوي للأنزيمات. ومع ذلك ، يجب أن يكون تركيز Mg 2+ دائمًا أعلى من تركيز dNTP.
    3. تلف قالب الحمض النووي
      الحد من وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية عند تحليل أو إخراج منتجات PCR من المواد الهلامية.

    ما هي مثبطات PCR؟

    تُعرف الشوائب التي تتداخل مع تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باسم مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل. توجد مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل في مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع العينات وقد تؤدي إلى انخفاض حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل أو حتى نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل السلبية الكاذبة. قد يكون لمثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أصول عضوية وغير عضوية (شريدر 2012).

    تشمل مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل غير العضوية:

    • الكالسيوم أو أيونات المعادن الأخرى التي تتنافس مع المغنيسيوم
    • EDTA الذي يرتبط بالمغنيسيوم ويقلل من تركيزه

    تتضمن بعض مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل العضوية:

    • السكريات المتعددة والجليكوليبيدات التي تحاكي بنية الأحماض النووية ، وتتداخل مع المواد الأولية المرتبطة بالقالب
    • الميلانين والكولاجين اللذان يشكلان مركبًا عكسيًا مع بوليميراز الحمض النووي
    • الأحماض الدبالية التي تتفاعل مع قالب الحمض النووي والبوليميراز ، مما يمنع التفاعل الإنزيمي ، حتى عند التركيزات المنخفضة
    • اليوريا التي قد تؤدي إلى تحلل البوليميراز

    تشمل المركبات العضوية الأخرى التي يمكن أن تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل ما يلي:

    • الهيموجلوبين واللاكتوفيرين والغلوبولين المناعي في عينات الدم أو المصل أو البلازما
    • مضادات التخثر مثل الهيبارين
    • البوليفينول والبكتين والزيلان من النباتات
    • الإيثانول أو كحول الأيزوبروبيل أو الفينول أو المنظفات مثل SDS

    إذا كانت المثبطات موجودة في إعداد القالب ، فقد يؤدي التخفيف بمقدار 100 ضعف لقالب البداية إلى تخفيف المانع بشكل كافٍ والسماح بالتضخيم. بدلاً من ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى ترسيب الإيثانول في القالب لحل المشكلة.

    مراجع

    شريدر ، سي. وآخرون. مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل وظهورها وخصائصها وإزالتها. J أبل ميكروبيول. 113: 1014 و ndash1026 (2012).

    ما هو الإفراط في استخدام PCR؟ كيف أعرف ما إذا كان المنتج الخاص بي قد أفرط في التدوير؟

    يحدث الإفراط في تدوير تفاعل البوليميراز المتسلسل عندما يتجاوز ركوب الدراجات المرحلة الأسية للتضخيم. يحدث الإفراط في التدوير عندما تحدث الأحداث التالية أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل:

    • نضوب الركائز (dNTPs أو الاشعال).
    • لم تعد الكواشف (dNTPs أو الإنزيمات) مستقرة عند درجة حرارة التمسخ.
    • يتم تثبيط بوليميراز PCR بواسطة المنتج (بيروفوسفات ، DNA مزدوج).
    • التنافس على الكواشف (dNTPs والبادئات) بواسطة منتجات غير محددة.
    • خفض الرقم الهيدروجيني للتفاعل.
    • تمسخ غير كامل / فصل حبلا للمنتجات بتركيزات عالية من المنتج.

    مؤشر استخدام PCR المفرط هو مسحة خلفية مكثفة مع نطاقات لا يمكن تمييزها عندما يتم حل التفاعل على هلام الاغاروز. يوصى دائمًا بإجراء اختبار أولي لتحديد الحد الأدنى من دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل اللازمة لإنتاج منتج كافٍ. يبقى منتج PCR في المرحلة الخطية للتضخيم إذا زاد إنتاجية المنتج بشكل ملحوظ كل 3 & ndash5 دورات. نجد ذلك زيادة التدوير لا تنتج (كدنا) قالبًا مناسبًا لأي تطبيق لاحق.

    ما أنواع الطفرات التي يمكن أن تسببها تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

    يمكن أن تقدم بوليمرات PCR أنواعًا مختلفة من الطفرات ، بما في ذلك الاستبدالات أحادية القاعدة ، والحذف ، والإدخال. عادةً ما تحدث بدائل القاعدة عن طريق الخطأ في دمج dNTP غير الصحيح أثناء تخليق الحمض النووي.

    قد تولد البوليميرات طفرات في المواقع التي يتم فيها فقد أو اكتساب واحد أو أكثر من النيوكليوتيدات. يمكن أن يعتمد تواتر هذا النوع من الطفرات على التسلسل ، وقد يكون أعلى في التسلسلات شديدة التكرار. الطفرة الأكثر شيوعًا هي فقدان نيوكليوتيد واحد ، والذي يمكن أن يكون نتيجة لخلل في محاذاة القالب التمهيدي داخل تسلسل متماثل متكرر. يمكن أن تحدث إعادة ترتيب الحمض النووي أيضًا عندما ينهي البوليميراز التوليف على خيط DNA واحد ويستمر في التوليف بعد حدوث التهيئة على حبلا تكميليًا (على سبيل المثال ، تبديل الجديلة أو القفز PCR). يحدث هذا النوع من الطفرات عندما يكون هناك تجانس كبير بين مناطق مختلفة من الحمض النووي. قد يؤدي أيضًا قالب الحمض النووي الزائد في التفاعل إلى تعزيز هذا النوع من الطفرات.

    ما هي العوامل التي تساهم في حدوث الطفرات التي تدخل في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؟

    يمكن أن تساهم العوامل التالية في حدوث الطفرات التي تدخل في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR):

    • تركيزات dNTP غير المتوازنة
      يمكن أن تؤدي الكميات غير المتكافئة من dNTPs الأربعة إلى زيادة الاستبدال الأساسي بمقدار ثمانية أضعاف. يعد استخدام تركيزات متساوية من dNTPs الأربعة أمرًا بالغ الأهمية لتقليل معدل الخطأ في البوليميراز.
    • تركيز انزيم عالي
    • فترات حضانة طويلة
    • عدم وجود نشاط نوكلياز خارجي 3 'و rarr5'
    • تركيز المغنيسيوم
      تبلغ الدقة القصوى عندما يكون تركيز Mg 2+ متساويًا مع التركيز الكلي لـ dNTPs. تنخفض الدقة عند زيادة تركيز الكاتيونات ثنائية التكافؤ الحرة.
    • درجة الحموضة للتفاعل
      يمكن أن يؤدي خفض الرقم الهيدروجيني للتفاعل بمقدار ثلاث وحدات إلى زيادة البدائل الأساسية حتى 60 ضعفًا. قد يؤدي انخفاض درجة الحموضة (& lt6.0) إلى فقدان البيورين تلقائيًا.
    • تلف الحمض النووي
      يمكن أن يحدث تلف الحمض النووي في درجات حرارة عالية ، مما قد يزيد من معدل الطفرات. الطفرة المتكررة هي نزع أمين السيتوزين لإنتاج اليوراسيل.
    • يمتد وجود A في تسلسل التمهيدي
    • الإفراط في التدوير
      يزداد معدل الخطأ عندما يزداد تركيز الحمض النووي خلال دورات PCR النهائية. يجب الحفاظ على العدد الإجمالي للدورات عند الحد الأدنى لإنتاج منتج PCR المطلوب دون أخطاء.

    ما هي مصنوعات PCR؟

    فيما يلي عيوب PCR الشائعة:

    • التمهيدي ديمرز
      يتم تشكيل ثنائيات التمهيدي من خلال التكامل الذاتي في نهاية 3 'من بادئات التضخيم. يشتبه في ثنائيات التمهيدي إذا تم إنتاج المنتج في تفاعل خالٍ من القالب (تحكم سلبي). لتجنب ثنائيات البرايمر ، لا ينبغي أن تحتوي البرايمر على تكامل في نهاياتها الثلاثة.
    • منتجات Chimeric PCR
      يمكن أن تكون منتجات Chimeric PCR ناتجة عن قالب ممتد بشكل غير كامل. بعبارة أخرى ، يمكن للقالب أحادي الخيط الذي لم يتم نسخه بشكل كامل بسبب إنهاء البوليميراز السابق لأوانه أن يصلب إلى قالب متجانس جزئيًا. هذا يخلق منتجات PCR خيالية. لتقليل الكيميرا ، استخدم أقل عدد ممكن من دورات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    • تحيز PCR
      يحدث تحيز تفاعل البوليميراز المتسلسل عندما يتم تضخيم بعض التسلسلات بشكل أكثر كفاءة من غيرها بسبب الارتباط التفضيلي بواسطة بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل. إذا تم تضخيم تسلسل واحد بنسبة 10٪ أكثر من تسلسل آخر في دورة واحدة ، فسيكون أكثر وفرة بمقدار 17.4 مرة بعد 30 دورة. لتقليل تحيز تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم معدل منحدر مرتفع بين خطوات التمسخ والصلب واستخدم درجات حرارة التلدين المنخفضة. يجب تجنب فترات التمديد الطويلة (& gt180 ثانية).
    • الانجراف PCR
      يرجع انجراف تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى التقلب العشوائي في تفاعلات كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل ، خاصة في الدورات المبكرة عندما يكون تركيز القالب منخفضًا جدًا. لوحظت هذه القطعة الأثرية في فحوصات تعدد الإرسال ، حيث يحدث فقدان الحساسية بسبب التفاعلات بين مجموعات مختلفة من البادئات. من المهم أن تصمم بعناية مواد أولية لهذه الأنواع من المقايسات.
    • ينتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) منتجات ذات وزن جزيئي عالٍ بالكاد تنتقل من خلال هلام الاغاروز
      لا يوجد تفسير جيد لهذه الأداة. يفترض معظم الباحثين أن هذا ناتج عن التدوير المفرط ، لأنه في المراحل اللاحقة من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تتراكم الجزيئات المفردة والمزدوجة. يمكن أن يؤدي تراكم مثل هذه الجزيئات أحادية الجديلة إلى حدوث مضاعفات مضاعفة غير متجانسة عن طريق التنافس مع البادئات. عدم اكتمال التمسخ في المراحل اللاحقة ، عندما يكون هناك تركيز عالٍ من منتجات PCR ، يمنع فصل خيوط الحمض النووي ، وبالتالي قد يظل amplicon المشكل حديثًا مرتبطًا بالقالب المصنوع مسبقًا. يمكن أن تتكرر هذه العملية ، محاصرة نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل في شبكة من الجزيئات.

    التفسير الآخر لأصل اللطاخات عالية الوزن الجزيئي هو الامتداد الجزئي للقوالب أثناء دورات PCR الأولية. يمكن إنشاء الامتدادات الجزئية عن طريق القفز على القطع الأثرية و [مدش] عندما يصلب دنا تمهيدي أو أحادي الجديلة ويمتد من موقع فتيل واحد ، ثم يصلب جزئيًا إلى جزء متماثل في مكان آخر (انظر منتجات PCR الكيميرية ، أعلاه). يمكن للجزيئات الممتدة جزئيًا أن تعمل بمثابة بادئات جديدة ، لأنها تحتوي على 3'-OH مجانًا ، ويمكن أن تولد جزيئات خيمرية تجمع بين موقع التمهيد الأولي وموقع "القفز".

    أخيرًا ، يمكن أيضًا إنشاء هذا النوع من القطع الأثرية عند استخدام قالب خام لـ PCR. يمكن أن تصبح المنتجات التي يتم تضخيمها مباشرة من الأنسجة الحيوانية أو النباتية محاصرة في بقايا الخلايا ، مما يمنعها من الانتقال في الهلام. يمكن حل هذه المشكلة عن طريق هضم بروتيناز K لمنتج PCR المضخم:

    • قبل تحميل العينات على مادة هلامية ، أضف 1 وميكرول من المخزن المؤقت للتحميل الذي يحتوي على بروتيناز K إلى 4 وماكرول من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

    Takara Bio USA، Inc.
    الولايات المتحدة / كندا: +1.800.662.2566 & bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 & Bull Europe: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japan: +81. (0) 77.565.6999
    لأغراض البحث فقط. ليس للاستخدام في إجراءات التشخيص. & نسخ 2021 Takara Bio Inc. جميع الحقوق محفوظة. جميع العلامات التجارية مملوكة لشركة Takara Bio Inc. أو الشركات التابعة لها في الولايات المتحدة و / أو البلدان الأخرى أو أصحابها المعنيين. قد لا يتم تسجيل بعض العلامات التجارية في جميع الولايات القضائية. يتوفر المنتج الإضافي والملكية الفكرية ومعلومات الاستخدام المقيد على takarabio.com.

    Takara Bio Europe عضو في Takara Bio Group ، وهي شركة رائدة في علوم الحياة ملتزمة بتحسين حالة الإنسان من خلال التكنولوجيا الحيوية. من خلال علاماتنا التجارية Takara و Clontech و Cellartis ، تتمثل مهمتنا في تطوير أدوات وخدمات مبتكرة عالية الجودة لتسريع الاكتشاف.


    تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) | التكنولوجيا الحيوية

    تقدم المقالة المذكورة أدناه دليل المبتدئين لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد قراءة هذا المقال سوف تتعرف على: 1. تاريخ PCR 2. مبدأ تفاعل البلمرة المتسلسل 3. متطلبات PCR 4. دورة تفاعل PCR 5. تحليل منتجات PCR 6. التطبيقات 7. الاحتياطات والعيوب 8. التعديلات.

    1. تاريخ PCR
    2. مبدأ تفاعل البلمرة المتسلسل
    3. متطلبات PCR
    4. دورة تفاعل PCR
    5. تحليل منتجات PCR
    6. تطبيقات PCR
    7. الاحتياطات والعيوب
    8. التعديلات

    1. تاريخ PCR:

    تعود فكرة PCR إلى Kary-Mullis الذي كان عالم أبحاث في 1980s في شركة Cali & shyfornia للتكنولوجيا الحيوية تسمى Cetus. أظهر موليس وخمسة باحثين آخرين في قسم الوراثة البشرية في Cetus ، أنه يمكن استخدام بادئات قليلة النوكليوتيد لتضخيم أجزاء محددة من DNA ge & shynomic (أو cDNA). فاز موليس بجائزة نوبل في الكيمياء عام 1993.

    2. مبدأ تفاعل البلمرة المتسلسل:

    تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عبارة عن تضخيم إنزيمي تمهيدي بوساطة لتسلسلات الحمض النووي الجيني المحدد والمستنسخة بطريقة غير منتظمة. في هذه العملية ، نأخذ الحمض النووي بسلسلة مستهدفة وخجل نريد تضخيمه ، ونفسد طبيعته عن طريق زيادة درجة الحرارة ثم استخدام تمهيدي محدد للتسلسل لتضخيم تسلسل هدفنا بمساعدة بوليميراز الحمض النووي للجدول والشيموس.

    في هذه التقنية نحاول إعادة إنتاج بيئة اصطناعية في ظل ظروف المختبر حيث يخضع تسلسل الحمض النووي المستهدف لجولات متعددة من دورة النسخ المتماثل لإنتاج شرطي وخجول هائلين من الجين المستهدف.

    تتكون عملية PCR من ثلاث خطوات أساسية:

    الخطوة 1:

    تمسخ قالب الحمض النووي مزدوج الشريطة عن طريق زيادة درجة الحرارة و shyture إلى 94 & # 8211 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لمدة 2 ميل و shynutes.

    الخطوة 2:

    تصلب اثنين من البادئات قليلة النوكليوتيد إلى درجة الحرارة أحادية السلسلة والصفائح عن طريق خفض درجة الحرارة إلى 50 - 65 درجة مئوية.

    الخطوه 3:

    التمديد الأنزيمي للبادئات لإنتاج نسخ يمكن أن تكون بمثابة مؤقت وألواح خشبية في الدورات اللاحقة.

    3. متطلبات PCR:

    (أ) قالب DNA:

    يسمى جزيء الحمض النووي الأصلي الذي سيتم نسخه بقالب الحمض النووي ، ويعرف الجزء الذي سيتم تضخيمه بالفعل باسم تسلسل القطران والخجول. كمية التتبع لقالب الحمض النووي كافية. يمكن الحصول على هذا من خلال أي من تقنيات عزل الحمض النووي التي تمت مناقشتها من قبل.

    (ب) بادئات PCR:

    هناك حاجة إلى اثنين من البادئات PCR لبدء تخليق الحمض النووي. هذه قطع قصيرة من الحمض النووي أحادي الجديلة تتطابق مع التسلسلات في أي من طرفي مقطع الحمض النووي المستهدف. تصنع بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة التوليف الكيميائي للحمض النووي.

    هناك العديد من برامج الكمبيوتر المتاحة لاقتراح مواد أولية مناسبة لعملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ويتم سرد بعض الإرشادات العامة والإرشادات أدناه:

    تميل البادئات الأقصر إلى الانتقال والصلب إلى التسلسل غير المستهدف لقالب الحمض النووي. سيؤدي ذلك إلى إنتاج نسخ DNA ذات تسلسل غير مستهدف. كلما زاد تعقيد قالب الحمض النووي ، زاد احتمال حدوث ذلك.

    وبالتالي ، قد يوفر التمهيدي القصير خصوصية كافية عند التضخيم باستخدام قالب بسيط مثل البلازميد الصغير ، ولكن يمكن إعادة التمهيدي الطويل والتخفيض عند استخدام الحمض النووي الجيني حقيقيات النوى كقالب. في الممارسة العملية ، 20-30 نيوكليوتيدات مرضية بشكل عام.

    لا تحتاج البادئات إلى مطابقة القالب تمامًا ، على الرغم من أن الطرف 3 & # 8242 من التمهيدي يجب أن يقترن بشكل صحيح بالقالب ، وإلا فلن يتمكن البوليميراز من تمديده. غالبًا ما يكون من المفيد أن يكون لديك C أو G مثل النوكليوتيد الطرفي 3 & # 8242. هذا يجعل ربط الطرف 3 & # 8242 من التمهيدي مع tem & shyplate أكثر ثباتًا مما سيكون عليه مع A أو T في 3 & # 8242 النهاية.

    3. درجة حرارة الانصهار:

    يجب أن تكون درجات الحرارة التي يمكن أن يقترن عندها البادئون مع القالب متشابهة ومتناسقة لضمان ارتباط كلاهما في نفس الوقت تقريبًا حيث تنخفض درجات الحرارة وتنخفض أثناء التلدين. من المحتمل أن يعني التشابه بين درجات حرارة الانصهار أن البادئات لها تركيبة نيوكليوتيدية مماثلة.

    4. الهيكل الثانوي الداخلي:

    يجب تجنب ذلك لمنع التمهيدي من الانثناء مرة أخرى على نفسه وعدم الاستفادة منه وقابليته للارتباط بالقالب.

    5. التلدين التمهيدي التمهيدي:

    من المهم أيضًا تجنب قدرة البادئين على التصلب مع بعضهما البعض. يؤدي التمديد بواسطة بوليميراز الحمض النووي لاثنين من المواد الأولية الصلبة والخجول إلى تكوين ثنائي التمهيدي.

    (ج) بوليميراز الحمض النووي المستقر حرارياً:

    إن إنزيم DNA polymerase ضروري لتصنيع نسخ DNA. كان جزء Klenow أول إنزيم بوليميريز DNA يستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل. شظية Klenow هي جزء كبير من البروتين ينتج عندما ينقسم DNA polymerase I من E. coli بواسطة الإنزيم البروتيني subtilisin.

    بعد التعديل الأنزيمي ، فإنه يحتفظ بنشاط البوليميراز 5 & # 8242-3 & # 8242 ونشاط نوكلياز خارجي 3 & # 8242 → 5 & # 8242 لإعادة إزالة النيوكليوتيدات المشفرة مسبقًا وإثباتها وتخجلها ، ولكنه يفقد نشاطه 5 & # 8242 → 3 & # 8242.

    فشل جزء Klenow في لعب دور ناجح باعتباره إنزيم بوليميراز لافتقاره إلى الاستقرار عند درجة حرارة عالية. كما نعلم أن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يتضمن العديد من خطوات درجة الحرارة ، في هذا الموقع والأمر كان علينا تجديد جزء Klenow والخجل خلال كل دورة.

    لحل هذه المشكلة ، كانت هناك حاجة إلى بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة. جاء هذا في الأصل من البكتيريا المقاومة للحرارة التي تعيش في الينابيع الساخنة عند درجات حرارة تصل إلى 90 درجة مئوية. اليوم Taq poly & shymerase من Thermusaquaticus هو أكثر إنزيم بوليميريز DNA PCR استخدامًا. يتم إنتاجه بشكل عام عن طريق expres & shysion من الجين في E. coli.

    تساعد القوة الحرارية وخجل إنزيم Taq في نقاوته وخجله بعد التعبير في الإشريكية القولونية ، حيث يمكن تلوث بروتينات الإشريكية القولونية ويمكن أن تتأثر بالتسخين. يحتوي الإنزيم على 5 & # 8242-3 & # 8242 بوليميريز DNA و 5 & # 8242-3 & # 8242 أنشطة نوكلياز خارجية. سوف تتبلمر حوالي 50-60 نيوكليوتيد في الثانية. ومع ذلك ، فإن en & shyzyme له عدد من الخصائص التي قد تكون غير مواتية.

    1. لا يحتوي Taq Polymerase على دليل على القراءة (3 & # 8242-5 & # 8242 نوكلياز خارجي) النشاط:

    وبالتالي فإن حوالي نيوكليوتيد واحد في 10 4 in & shycorporated غير صحيح ، وستكون المنتجات الفردية وخيوط تفاعل البوليميراز المتسلسل مجموعة غير متجانسة من السكان.

    2. يتميز Taq Polymerase بإنتاجية منخفضة نسبيًا:

    هذا يعني أنه من المحتمل أن ينفصل عن القالب قبل أن يصنع قطعة طويلة من الحمض النووي.

    3. Taq Polymerase ليس مستقرًا تمامًا للحرارة:

    يبلغ عمر النصف حوالي 40 دقيقة عند 95 درجة مئوية ، مما يعني أنه سيكون هناك خسارة كبيرة في النشاط على مدار 30 دورة أو نحو ذلك المستخدمة في تجربة PCR نموذجية. لذلك ، قد يكون من الضروري إضافة المزيد من الإنزيم خلال فترة سابقة وخجل.

    4. يتضمن Taq Polymerase Ex & shytra a Residue:

    تم دمج هذا في الطرف 3 & # 8242 من الخلد & shycule المركب ، ولم يتم ترميزه في القالب. يتوفر عدد من polymerases من أنواع أخرى من Thermus. وتشمل هذه إنزيمات Tfl و Tth من Thermusflavus و Thermusthermophilus على التوالي.

    لا تحتوي هذه بشكل عام على 3 & # 8242-5 & # 8242 دليل القراءة ac & shytivity. تتوفر البوليميرات أيضًا من أجناس أخرى من البكتيريا (بما في ذلك البكتيريا البدائية) ، والعديد من هذه الإنزيمات لديها 3 & # 8242-5 & # 8242 نشاط تدقيق للقراءة (مما يعني أيضًا أنها لا تضيف عادة نيوكليوتيدات نهائية غير موجهة بالقوالب).

    تشمل en & shyzymes إثبات القراءة Tli من Thermococcuslitoraiis و Pfu من Pyrococcusfuriosus. تنمو هذه البكتيريا البحرية بشكل عام في درجات حرارة أعلى من Thermusaquaticus ، وتكون البوليمرات أكثر استقرارًا وأكثر استقرارًا من إنزيم Taq.

    (د) Deoxy Nucleotide Triphosphates:

    يحتاج البوليميراز إلى إمداد أربعة ديوكسينوكليوتيد ثلاثي وشيفات ، dATP ، dCTP ، dGTP و dTTP ، لصنع الحمض النووي الجديد.

    (هـ) آلة PCR:

    أخيرًا ، نحتاج إلى جهاز PCR للاستمرار في تغيير درجة الحرارة والغطاء. تتطلب عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ركوب الدراجات عبر درجات حرارة مختلفة. لهذا السبب ، تسمى آلات تفاعل البوليميراز المتسلسل أحيانًا بالدورات الحرارية.

    4. دورة تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل:

    إن تفاعل البوليميراز المتسلسل هو تفاعل تسلسلي لأن خيوط الدنا المركبة حديثًا ستعمل كقالب لمزيد من تخليق الحمض النووي في الدورة اللاحقة. بعد 25 دورة من تخليق الحمض النووي ، ستشمل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، بالإضافة إلى DNA البداية والخجول ، حوالي 10 5 نسخ من تسلسل القطران والخجول المحدد.

    يتكون تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من سلسلة من الدورات من ثلاث تفاعلات متتالية:

    خطوة تمسخ:

    هذه الخطوة هي أول حدث دوري منتظم وتتكون من تسخين التفاعل إلى 94-98 درجة مئوية لمدة 20-30 ثانية. يتسبب في ذوبان قالب الحمض النووي عن طريق تعطيل الروابط الهيدروجينية بين القواعد التكميلية ، مما ينتج عنه جزيئات DNA أحادية السلسلة.

    خطوة التلدين:

    يتم خفض درجة حرارة التفاعل والغطاء إلى 50-65 درجة مئوية لمدة 20-40 ثانية مما يسمح بتليين البادئات إلى قالب الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل. عادةً ما تكون درجة الحرارة الصلبة والخجولة حوالي 3-5 درجات مئوية تحت T.م من الاشعال المستخدمة.

    تم يمكن تحديدها تجريبياً أو الحساب من الصيغة التالية:

    تيم = (4 × [G + C]) + (2 × [A + T]) درجة مئوية

    تتشكل روابط الهيدروجين DNA-DNA المستقرة فقط عندما يتطابق التسلسل التمهيدي مع تسلسل القالب بشكل وثيق. يرتبط البولي والشميريز بالهجين التمهيدي ويبدأ في تخليق الحمض النووي.

    خطوة التمديد / الاستطالة:

    تعتمد درجة الحرارة والضغط في هذه الخطوة على DNA poly & shymerase المستخدم. يحتوي Taq polymerase على درجة حرارة نشاطه Opti & shymum عند 75-80 درجة مئوية ، وعادة ما يتم استخدام درجة حرارة 72 درجة مئوية مع هذا الإنزيم. في هذه الخطوة ، يقوم بوليميراز الحمض النووي بتركيب خيط DNA جديد مكمل لقالب قالب الحمض النووي عن طريق إضافة dNTPs المكملة للقالب في اتجاه 5 & # 8242 إلى 3 & # 8242.

    يعتمد وقت التمديد على بوليميريز الحمض النووي المستخدم وعلى طول جزء الحمض النووي المراد تضخيمه. كقاعدة عامة ، عند درجة الحرارة المثلى ، يقوم بوليميراز الحمض النووي بلمرة ألف قاعدة في الدقيقة.

    في ظل الظروف المثلى ، على سبيل المثال ، إذا لم تكن هناك قيود بسبب تقييد الركائز أو الكواشف ، في كل خطوة تمديد ، تتم مضاعفة كمية هدف الحمض النووي ، مما يؤدي إلى تضخيم أسي (هندسي) لجزء الحمض النووي المحدد.

    على سبيل المثال ، إذا بدأ المرء بجزيء DNA مزدوج الشريطة ، فبعد 20 دورة ، يصبح عدد جزيئات جزيء الحمض النووي المركب بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل 1 & # 21510 6 ، وبعد 30 دورة ، يزداد عدد جزيئات الحمض النووي والمول الخجول إلى 1 & # 21510 9.

    يمكن حساب هذا الرقم بمساعدة الصيغة التالية:

    أين مF هو العدد النهائي من جزيئات الحمض النووي التي تنتجها PCR، M.F هي الكمية الأولية لجزيئات الحمض النووي ، و n هي عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل.

    استطالة نهائية:

    يتم تنفيذ هذه الخطوة المفردة في درجة حرارة 70-74 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة بعد آخر دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل للتأكد من أن أي DNA متبقي أحادي الجدي تم تمديده بالكامل.

    5. تحليل منتجات PCR:

    غالبًا ما يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كتقنية للحصول على معلومات وتسلسل حول قالب الحمض النووي الذي يحمل تسلسلًا مستهدفًا محددًا. تعتمد إعادة البحث عن التكنولوجيا الحيوية على نطاق واسع على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في مواقف مختلفة. ومن ثم هناك عدة طرق لتحليل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.

    اتباع ثلاث تقنيات مهمة:

    (أ) الرحلان الكهربائي الهلامي لمنتجات PCR:

    تم تأكيد النتائج النهائية لمعظم تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل بإخضاع جزء من خليط التفاعل المتضخم إلى الاغاروز الكهربائي للهلام. هذا يمكن أن يخبرنا بصحة تجربة PCR. في حالة عدم وجود النطاق السابق والخطي أثناء تصور الهلام ، أو في حالة وجود نطاقات إضافية ، فقد حدث خطأ ما ويجب تكرار التجربة والخجل.

    في بعض الحالات ، يستخدم الاغاروز الكهربائي للهلام ليس فقط لتحديد ما إذا كانت تجربة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قد نجحت ، ولكن أيضًا للحصول على معلومات إضافية. يمكننا أيضًا تحديد وجود موقع التقييد في الحمض النووي للقالب عن طريق إخضاع منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى نوكلياز داخلي لإعادة التضييق والتضييق قبل الرحلان الكهربائي والكهربائي.

    هذا البروتوكول هو نوع من تحليل تعدد الأشكال (RFLP) الذي له أهمية كبيرة في بناء خرائط الجينوم ودراسة الأمراض الوراثية. يمكن أن يساعدنا التحليل الكهربي لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل أيضًا في تحديد طفرة الإدراج أو التخلخل في المنطقة المضخمة.

    (ب) استنساخ منتجات PCR:

    أثناء تجربة الاستنساخ عدة مرات نأخذ مساعدة PCR مباشرة. إذا كان جين in & shyterest بكمية أقل ، فنحن بحاجة إلى تضخيمه. يتم ذلك بمساعدة PCR الذي ينتج نسخًا كافية من الحمض النووي المستهدف حتى نتمكن من بدء التجربة.

    (ج) تسلسل منتجات PCR:

    يتم إجراء عملية عزل منتج PCR بمساعدة جهاز التسلسل الآلي. ليست هناك حاجة للراديو- la & shybelling و autoradiography. هذه طريقة محجوبة وخجولة لتسلسل الحمض النووي بسبب سرعته ولأنه يمكن تحليله بواسطة الكمبيوتر بدلاً من شخص.

    يحتوي PCR على عدد من التطبيقات خاصة عندما تكون السرعة وعدد العينات المراد معالجتها مهمين أو حيث تكون كمية الحمض النووي المتاحة محدودة للغاية. فيما يلي بعض التطبيقات.

    أ. تسلسل الحمض النووي:

    تفاعل البوليميراز المتسلسل في وجود ثنائي ديوكسينوكليوزيد ثلاثي الفوسفات (ddNTPs) ، المستخدم في تسلسل الحمض النووي ، تفاعلات تسلسل الحمض النووي مع كميات صغيرة جدًا من القالب.

    ب. التشخيص:

    يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مفيدًا كأداة تشخيصية ، على سبيل المثال ، في تحديد سمات وراثية معينة أو للكشف عن الممرضات والمسببات المرضية أو الملوثات الغذائية. من أولى تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل في التشخيص الجيني هو فقر الدم المنجلي.

    ج. الطب الشرعي:

    تؤدي القدرة على تضخيم الحمض النووي من مناطق الجينوم شديدة التعدد (والمتغيرة بين الأفراد) بدءًا من العينات التي تحتوي على كميات صغيرة جدًا من الحمض النووي (على سبيل المثال ، الشعيرات المفردة أو آثار سوائل الجسم ، مثل الدم والسائل المنوي) إلى تطبيقات وأعمال الطب الشرعي.

    د. علم الوراثة السكانية في الوقت الحاضر:

    إنه كذلك لتحديد ترددات أليلات معينة في مجموعة كبيرة من الأفراد. من المزايا الخاصة بنا والخجل من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الدراسات الجينية السكانية أنه ، مع بادئات محددة مصممة بشكل مناسب ، قد يكون من الممكن تضخيم الحمض النووي من كائن حي لا يمكن فصله عن الآخرين ، مثل سلالة بكتيرية معينة في مجموعة سكانية مختلطة.

    (ستصلب مثل هذه المواد الأولية إلى الحمض النووي المستهدف من الكائن الحي محل الاهتمام ، ولكن ليس من الحمض النووي من الآخرين.)

    ه. علم الآثار والتطور:

    يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع المواد القديمة بالإضافة إلى المزيد من العينات المعاد تدويرها ، وغالبًا ما يكون من الممكن تضخيم الحمض النووي القديم من أنواع المتاحف والأغشية والبقايا الأثرية. في الغالب يتم استخدام DNA الميتوكوندريا أو DNA البلاستيدات الخضراء. هذا يسمح بإجراء استنتاجات حول أصول مجموعات أو أنواع معينة.

    7. الاحتياطات والعيوب:

    أنا. مقاس:

    حجم الشظايا التي يمكن صقلها وتقسيمها مقيد بمعالجة البوليميراز المستخدم. يؤدي استخدام مزيج من البوليميراز الذي يحتوي على إنزيم مقاوم ومخجل إلى زيادة حجم pro & shyduct التي يمكن الحصول عليها (حتى 10 كيلو بايت أو أكثر) ، لأنه يمكن إزالة النيوكليوتيدات المدمجة بشكل غير صحيح بدلاً من التسبب في إنهاء السلسلة.

    ثانيا. تضخيم التسلسل الخاطئ:

    يعتمد PCR على قدرة البادئات على التصلب بالتسلسل الصحيح ، وهذا يعتمد على ظروف التلدين (التركيز الأيوني ، درجة الحرارة ، إلخ) والتسلسل الفعلي (أو المتواليات إذا تم تضمين المواقع المختلطة) من البادئات.

    من الممكن أن تصلب البرايمر إلى & # 8220 خاطئ & # 8221 جزء من الحمض النووي المستهدف ، من خلال تكامل الصدفة. إذا حدث هذا وتصلب البرايمر في الاتجاه الصحيح والخجل لبعضهما البعض (أي ، توجيه التزامن والخجل تجاه بعضهما البعض) وفي مواقع ليست بعيدة جدًا ، فإن النتيجة هي تضخيم تسلسل آخر غير المطلوب.

    يمكن تجنب احتمال التلدين غير الصحيح باستخدام مواد أولية أطول ، والتي ستكون أكثر تحديدًا في مواقع التلدين. يمكن استخدام رفع درجة الحرارة وضبط وتقليل تركيز أيونات المغنيسيوم (التي تعمل على استقرار ربط القالب التمهيدي) لزيادة خصوصية الربط التمهيدي.

    ثالثا. تلوث اشعاعى:

    بسبب الحساسية الخارجية والخطيرة لـ PCR ، هناك خطر متكافئ وملفوف من تلوث عينة الحمض النووي لتضخيمها بمواد دخيلة. هذا مهم بشكل خاص عند استخدام مادة تحتوي على كميات صغيرة فقط من الحمض النووي ، كما هو الحال مع الأعمال الأثرية.

    قد يكون التلوث من أصل مختبر و shytory (على سبيل المثال ، من الهباء الجوي الذي تم إنشاؤه بواسطة محاليل الماصات التي تحتوي على تسلسلات الحمض النووي ذات الصلة ، بما في ذلك المواد التي تم تضخيمها سابقًا بواسطة PCR) أو من أصل خارجي وخجول (ربما عن طريق التلوث البكتيري أو الفطري أو البشري لأنسجة العينة).

    يمكن أن يكون التلوث المختبري صغيرًا ومضغوطًا من خلال الاحتياطات مثل الاستخدام الدقيق وتصميم الماصات ، وفصل مراحل ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من التجربة والخجل إلى غرف مختلفة. يمكن تقليل التلوث من مصادر أخرى عن طريق العناية والتعامل الخجول مع العينة قبل التضخيم.

    رابعا. عدم تجانس التسلسل:

    قد يؤدي التضخيم إلى ظهور مزيج من الجزيئات ذات التسلسلات المختلفة قليلاً.

    يمكن أن ينشأ خليط لعدة أسباب:

    إذا جاء الحمض النووي للقالب من فرد متغاير الزيجوت في الموضع المعني ، فيجب تمثيل كل من الأليلات الموجودة بكميات مماثلة في نواتج وخطوات تفاعل البوليميراز المتسلسل.

    (ب) عدم تجانس السكان:

    إذا جاء DNA tem & shyplate من عدة أفراد وخجول بدلاً من فرد واحد ، فقد يؤدي التباين واللامبالاة في السكان إلى عدم التجانس في المنتجات.

    (ج) تلف الحمض النووي وخطأ البوليميراز:

    يمكن أن تنشأ عدم التجانس أيضًا من تلف الحمض النووي قبل التضخيم ، خاصةً إذا لم يتم حفظ العينة بعناية. لذلك ، من المحتمل بشكل خاص أن تكون هذه مشكلة مع المواد الأثرية والطب الشرعي.

    V. قفز PCR:

    عندما يتم تضخيم الحمض النووي المتحلل ، قد يكون أي جزيء عينة معين ليس طويلاً بما يكفي لتمتد على كامل المسافة بين موقعي التحضير. ستكون النتيجة في الجولة الأولى من syn & shythesis امتدادًا من التمهيدي إلى نهاية جزيء مجزأ ، ولكن ليس على طول الطريق إلى موقع التمهيدي الثاني.

    كيف & خجول ، في جولة لاحقة من التوليف ، قد يصلب منتج التضخيم المقطوع إلى جزء مختلف من الحمض النووي الذي يحتوي على المنطقة المتبقية سليمة. سيسمح هذا بعد ذلك بتوليف منتج PCR الكامل. وهذا ما يسمى القفز PCR. لذلك من الممكن أحيانًا إنشاء منتجات PCR أطول من أي جزيء قالب مستقل و shyvidual. يمكن أن يكون هذا إعلانيًا وخجولًا عند تضخيم الحمض النووي السيئ التآكل.

    8. التعديلات:

    أ. Hot-Start PCR:

    بمجرد أن يتم خلط كل من إعادة تكوين تفاعل البوليميراز المتسلسل ومخلفاته معًا ، فمن الممكن أن يبدأ بوليميريز الحمض النووي في التوليف. قد يحدث هذا أثناء تسخين خليط إعادة الخجل لأول مرة ، ويكون عند درجة حرارة منخفضة بما يكفي للسماح بالتلدين غير المحدد للطلاء التمهيدي إلى القالب ، مما ينتج عنه مجموعة من المنتجات غير السريعة والرائعة.

    ستكون هذه المشكلة مسبقة الاختراق إذا لم يكن من الممكن حدوث تخليق الحمض النووي حتى تصل الدورة الأولى إلى درجة الحرارة القصوى. هذا هو أساس بدء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). في أبسط أشكالها ، لا تتم إضافة بوليميراز الحمض النووي إلى أنابيب التفاعل حتى تصل درجة حرارة انصهار الحمض النووي للدورة الأولى. هذا مرضٍ حيث تتم معالجة أعداد صغيرة من العينات ، ولكن ليس بأعداد كبيرة.

    ب. Touch-Down PCR:

    إن درجة حرارة التلدين والشيخوخة المستخدمة في PCR التقليدي هي عادة وبخجل عدة درجات أقل من الحد الأقصى الذي يمكن أن تظل فيه البادئات مقيدة بالحرارة والصفيحة ، لضمان الربط المستقر. ومع ذلك ، فإن هذا الاستخدام لدرجة الحرارة المنخفضة يسمح بقدر ضئيل من عدم التطابق بين البادئات والقالب ، مما قد يسمح للطلاء التمهيدي بالارتباط بالمواقع غير الصحيحة وتوليد المنتجات الزائفة وإخفائها.

    يمكن تقليل آثار ذلك عن طريق اللمس لأسفل PCR. في هذا ، يتم استخدام درجة حرارة التلدين العالية مبدئيًا (حيث قد لا يكون من الممكن حتى الربط الصحيح والخجل). يتم تقليل درجة حرارة التلدين في الجولات اللاحقة. وبالتالي ، ستأتي نقطة يكون عندها التلدين الصحيح للطلاء التمهيدي المطابق أمرًا ممكنًا ، لكن المطابقة غير الصحيحة والدمج ليست كذلك ، وستكون المنتجات المرغوبة والأكثر وفرة.

    ج. متداخلة PCR:

    هنا ، يتم إجراء تقريري PCR متتاليين. يستخدم أول PCR نموذجًا خادعًا ومخالفًا. ثم يتم استخدام منتجات أول PCR كقالب لـ PCR الثاني ، مع مواد أولية مصممة للتصلب داخل المنتج المطلوب من أول PCR.

    على الرغم من أن تفاعل البوليميراز المتسلسل الأول قد ينتج بعض المنتجات غير المحددة بالإضافة إلى المنتجات المرغوبة ، فمن غير المحتمل أن تحتوي المنتجات غير المحددة أيضًا على مواقع التلدين لكل من البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني. وبالتالي ، من المرجح أن تكون المنتجات المرغوبة من أول PCR قوالب مناسبة للثاني فقط.

    د. معكوس PCR:

    من الممكن ترتيب تضخيم التسلسلات خارج البادئات ، في تقنية تسمى معكوس PCR (IPCR). في هذه التقنية ، يتم قطع عينة الحمض النووي أولاً باستخدام إنزيم خارج المنطقة التي يكون تسلسلها معروفًا بالفعل.

    يتم بعد ذلك تعميم الجزيئات الخطية الناتجة عن طريق الربط تحت ظروف و shytions تفضل التفاعلات بين الجزيئات. ثم يتم إجراء عملية هضم تقييد ثانية ، باستخدام قطع إنزيم داخل منطقة التسلسل المعروف.

    والنتيجة الآن هي أن الجزء الأول الذي يحتوي على هذا التسلسل قد تم قلبه & # 8216 داخل الداخل & # 8217 ، تاركًا التسلسل المعروف من الخارج والمواد التي كانت تحيط به سابقًا. يمكن الآن استخدام مواد أولية مكملة للتسلسل المعروف على الجزء الخارجي من الخلد والكتلة لتضخيم منطقة الاهتمام بينهما.

    ه. عكس Transcriptase PCR:

    غالبًا ما يكون من الملائم تضخيم جزيئات الحمض النووي الريبي (RNA) ، ربما كخطوة تمهيدية لاستنساخها ، أو لتقدير وفرة mRNA معين في عينة. يتم ذلك عادةً عن طريق إجراء جولة من النسخ العكسي ، باستخدام إنزيم النسخ العكسي وبادئ واحد ، لعمل خيط واحد من cDNA قبل PCR نفسه.

    يمكن أن يكون التمهيدي للنسخ العكسي هو oligo-dT لتوليف cDNA العام من الرسائل المتعددة الأدينيلات ، أو يمكن أن يكون خاصًا برسالة معينة.

    F. في الموقع PCR:

    من الممكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الأنسجة المنفصلة ، مثل المقاطع الرقيقة على شريحة المجهر. يتطلب هذا جهاز PCR مكيفًا بشكل خاص لاستيعاب الشريحة. إذا كان من الممكن اكتشاف منتج PCR & shyuct (ربما عن طريق hybridiza & shytion ، أيضًا في الموقع) ، فهذا يسمح للشخص بتحديد مكان وجود الحمض النووي المستهدف في الأنسجة.

    ز. PCR غير متماثل:

    من خلال تقليل كمية أحد البادئين ، يكون من المناسب وغير المنطقي الترتيب للتضخيم التفضيلي والتقطيع لأحد الخيوط ، مما يؤدي إلى تحضير DNA أحادي السلسلة ، والذي له عدد من الاستخدامات في البيولوجيا الجزيئية. يُعرف التضخيم التفضيلي لشريط واحد بهذه الطريقة باسم تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتناظر والشديد.

    ح. مثبت PCR:

    يتم تطبيق PCR المثبت عند معرفة قطعة واحدة فقط من التسلسل (وبالتالي ، موقع فتيل واحد) للمنطقة محل الاهتمام. الهدف هو ربط المنطقة المراد تضخيمها بقطعة من التسلسل المعروف ثم استخدامها كموقع تحضير ثانٍ.

    هناك طريقتان يمكن من خلالهما القيام بذلك بسهولة. الأول هو تفتيت عينة الحمض النووي وربطها بجزيئات ذات تسلسل معروف ، مثل ناقل. يستخدم هذا التسلسل المعروف كأساس لتصميم واحد من اثنين من البادئات PCR. الطريقة الثانية هي إضافة ذيول بشكل إنزيمي إلى عينة الحمض النووي أو الجزيئات المنتجة بعد الجولة الأولى من التركيب.

    أنا. مستحلب PCR:

    في PCR التقليدي ، يتم إجراء التفاعلات داخل أنابيب بلاستيكية. من الممكن دمج جميع الكواشف داخل قطرات الدهون وتنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل على نطاق أصغر بكثير. هذا له مزايا معينة. من الممكن زيادة درجة حرارة القطرات الصغيرة وتقليلها بسرعة كبيرة.

    بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت كل قطرة تحتوي على جزيء قالب واحد في البداية ، فإن جميع المنتجات الموجودة في القطرة الفردية تنتج من am & shyplification لجزيء قالب واحد. وتسمى هذه الطريقة أيضًا بالقطيرة PCR.

    ي. التضخيم متساوي الحرارة:

    التسخين والتبريد المتكرر المطلوب بواسطة PCR lim & shyits مدى السرعة التي يمكن بها تنفيذ العملية. تم تطوير تضخيم وتضخيم متساوي الحرارة بوساطة حلقة (LAMP) ، مما يسمح بتضخيم القوالب عند درجة حرارة ثابتة (عادة حوالي 65 درجة مئوية).

    إنه يستخدم بوليميريز DNA مع نشاط إزاحة الخيوط ويتجنب الحاجة للتسخين لدرجات حرارة عالية. تستخدم هذه الطريقة للكشف عن مسببات الأمراض خارج المختبرات المتخصصة.

    ك. الوقت الحقيقي PCR:

    من الممكن استخدام PCR لتقدير وفرة جزيء حمض نووي معين في عينة. يمكن القيام بذلك عن طريق PCR في الوقت الحقيقي. ويمكن أن يتم ذلك بطريقتين.

    في الأول ، توجد صبغة ملزمة للحمض النووي الفلوري ، مزدوج السلسلة (dsDNA) (مثل SYBR الأخضر) في تفاعل البوليميراز المتسلسل. عندما يتراكم منتج dsDNA و shyuct ، تزداد كمية التألق من الصبغة ، ويمكن تفكيك ذلك وإزالته.

    تتطلب التجربة جهاز PCR و shychine مجهزًا أيضًا بمرفق قياس التألق. نظرًا لأن الطريقة تكتشف ببساطة dsDNA ، فإنها تقيس كمية منتج PCR في وقت معين بغض النظر عما إذا كان من المنطقة الصحيحة.

    الطريقة الثانية لاكتشاف PCR al & shylows في الوقت الفعلي لمنتج معين ، بدلاً من dsDNA بشكل عام ، ويستخدم بشكل خاص oligonucleotide مسبار متزامن ومختجل.تم تصميم هذا المسبار ليصلب داخل المنطقة المراد تضخيمها ويحمل صبغة مراسل الفلورسنت في أحد طرفيه ومخمد في الطرف الآخر من الجزيء.

    إذا كان المبرد والمراسل قريبين جدًا (على سبيل المثال ، مرتبطان بنفس قليل النوكليوتيد) ، عندئذٍ يوقف المبرد المراسل من التألق.

    أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، سيصلب المسبار إلى DNA أحادي الجديلة داخل المنطقة المستهدفة. عندما يلتقي poly & shymerase بالمسبار الملدن ، فإن نشاط الإنزيم الخارجي 5 & # 8242-3 & # 8242 يحط من المسبار ، مما يحرر المراسل من المخمد. وبالتالي ، فإن المراسل الفلوري يتكيف ويتراكم أثناء PCR. يظهر هذا النوع من آلية تفاعل البوليميراز المتسلسل في dia & shygram الموضح أعلاه.


    PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل)

    لنفترض أن لديك عينة بيولوجية بها كميات ضئيلة من الحمض النووي فيها. تريد العمل مع الحمض النووي ، ربما تميزه بالتسلسل ، لكن ليس هناك الكثير للعمل معه. وهنا يأتي دور PCR. PCR هو تضخيم كمية صغيرة من الحمض النووي إلى كمية أكبر. إنه سريع وسهل وآلي. تعني الكميات الكبيرة من الحمض النووي نتائج أكثر دقة وموثوقية لتقنياتك اللاحقة.

    يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لإنشاء "بصمة" للحمض النووي ، تكون فريدة لكل فرد. يمكن أن تكون بصمات الحمض النووي هذه مفيدة في تطبيقات العالم الواقعي المتعلقة بالأبوة / الأمومة والقرابة واختبار الطب الشرعي.

    تم تطوير هذه التقنية من قبل عالم الكيمياء الحيوية الحائز على جائزة نوبل كاري موليس في عام 1984 ، وهي تعتمد على اكتشاف النشاط البيولوجي في درجات حرارة عالية من بوليميرات الحمض النووي الموجودة في الحرارة (البكتيريا التي تعيش في الينابيع الساخنة).

    تعمل معظم بوليمرات الدنا (الإنزيمات التي تصنع دنا جديدًا) فقط في درجات حرارة منخفضة. ولكن في درجات الحرارة المنخفضة ، يتم لف الحمض النووي بإحكام ، لذلك لا تتمتع البوليميراز بفرصة كبيرة للحصول على معظم أجزاء الجزيئات.

    لكن بوليميرات الحمض النووي المحببة للحرارة تعمل عند 100 درجة مئوية ، وهي درجة حرارة يتم فيها تغيير طبيعة الحمض النووي (في شكل خطي). يسمى بوليميراز الحمض النووي المحب للحرارة هذا بوليميريز Taq ، الذي سمي على اسم تيهيرمس عبد القديرuaticus ، البكتيريا المشتقة منها.

    ومع ذلك ، فإن بوليميريز Taq ليس لديه القدرة على التدقيق اللغوي. تم اكتشاف بوليميرات أخرى مستقرة حرارياً ، مثل Vent و Pfu ، للعمل مع PCR والتصحيح اللغوي.

    ستحتاج إلى أربعة أشياء لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على عينة:

    1. العينة المستهدفة. هذه هي العينة البيولوجية التي تريد تضخيم الحمض النووي منها.

    2. تمهيدي. خيوط قصيرة من الحمض النووي تلتصق بالجزء المستهدف. يحددون جزء الحمض النووي المراد مضاعفته ويوفرون نقطة انطلاق للتكرار.

    3. طاق بوليميراز. هذا هو الإنزيم المسؤول عن تكرار الحمض النووي. هذا هو جزء البوليميراز من اسم تفاعل البلمرة المتسلسل.

    4. النيوكليوتيدات. ستحتاج إلى إضافة نيوكليوتيدات (dNTPs) حتى يكون لبوليميراز DNA اللبنات الأساسية للعمل معها.

    هناك ثلاث خطوات رئيسية لـ PCR وهي تتكرر مرارًا وتكرارًا ، عادةً من 25 إلى 75 مرة. هذا هو المكان الأكثر تقديرًا للأتمتة.

    1. يتم تسخين العينة المستهدفة. هذا يفسد الحمض النووي ، ويفككه ويكسر الروابط التي تربط بين خيطي جزيء الحمض النووي ، مما يتركك مع DNA واحد تقطعت به السبل (ssDNA).

    2. يتم تقليل درجة الحرارة وإضافة التمهيدي. تتمتع جزيئات التمهيدي الآن بفرصة الارتباط (التلدين) بقطع ssDNA. هذا يسمي أجزاء الحمض النووي التي سيتم تضخيمها ويوفر مكان انطلاق للتكرار.

    3. مصنوعة قطع جديدة من ssDNA. يعمل بوليميراز Taq على تحفيز توليد قطع جديدة من ssDNA تكون مكملة للأجزاء المميزة بالبادئات. تتمثل مهمة Taq polymerase في التحرك على طول خيط DNA واستخدامه كقالب لتجميع خيط جديد مكمل للقالب. هذا هو التفاعل المتسلسل في اسم تفاعل البلمرة المتسلسل.

    يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل فعالاً للغاية لأنه يضاعف الحمض النووي بشكل كبير لكل دورة من 25 إلى 75 دورة. تستغرق الدورة دقيقة واحدة فقط أو نحو ذلك ، ويمكن أن تعمل كل قطعة جديدة من الحمض النووي كقالب لأجزاء جديدة.

    ربما يكون أهم شيء يجب تذكره هو أن تكون مدركًا تمامًا للتلوث. إذا قمت ، على سبيل المثال ، بإزالة قطعة من الجلد في عينتك دون علمك ، إذن لك يمكن تضخيم الحمض النووي في تفاعل PCR. فيما يلي بعض العوامل الأخرى لتحسين نتائجك باستخدام PCR:

    1. تلدين درجة الحرارة. يبدأ من الطرف الأدنى لما تعتقد أنه سينجح ، ثم ينتقل للأعلى حسب الضرورة. إذا كانت درجة الحرارة منخفضة جدًا ، فإن البرايمر سترتكب المزيد من الأخطاء وستحصل على عدد كبير جدًا من الأشرطة عند تشغيل العينة على مادة هلامية. إذا كانت درجة الحرارة مرتفعة جدًا ، فلن تحصل على نتائج وسيصبح الجل فارغًا. يجب أن تكون درجة حرارة الانصهار حوالي 3 درجات مئوية إلى 5 درجات مئوية. الصيغة التقريبية لتحديد Tm هي Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T).

    2. تركيز المغنيسيوم. تريد أن يكون تركيز Mg2 + الخاص بك حوالي 1.5mM إلى 3mM. إذا انتقلت إلى مستويات عالية جدًا ، فسوف يرتكب البوليميراز المزيد من الأخطاء.

    3. فكر مليا في التصميم التمهيدي. يجب أن يحتوي كلا البادئين على نفس Tm تقريبًا حتى يصلب كلاهما عند نفس درجة الحرارة. يجب أن تكون قاعدتان من أصل ثلاث قواعد في الطرف 3 هي G أو C للحصول على تهجين جيد (يحتوي G و C على ثلاث روابط H حتى تحصل على بلمرة أفضل). أخيرًا ، تجنب ثنائيات البرايمر ، والتي تحدث عندما يكون للبادئات نهايات تتعطل مع بعضها البعض. هذا لن ينتج أي منتج.

    4. المزيد ليس بالضرورة أفضل. ينتج المزيد من البوليميراز المزيد من المنتجات غير النوعية ، لذلك لا تتخلص من مجموعة من البوليميراز بلا مبالاة. بالإضافة إلى ذلك ، لا تعمل تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل إذا كان هناك الكثير من الحمض النووي.

    لا يعمل Taq polymerase على عينات RNA ، لذلك لا يمكن استخدام PCR لتضخيم جزيئات RNA مباشرة. ومع ذلك ، يمكن دمج دمج إنزيم النسخ العكسي (RT) مع تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي للسماح بتضخيم جزيئات الحمض النووي الريبي. بعد إضافة عينة الحمض النووي الريبي إلى آلة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أضف مادة أولية للحمض النووي كالمعتاد واتركها تصلب إلى الجزيء المستهدف. ثم أضف RT جنبًا إلى جنب مع dNTPs ، والتي ستطيل من تمهيدي الحمض النووي وتصنع نسخة cDNA من جزيئات RNA وتشغيل تفاعل PRC كالمعتاد. منتج RT-PCR هو جزيء DNA مزدوج تقطعت به السبل مشابه للجزء المستهدف من جزيء RNA.


    شاهد الفيديو: What is Polymerase Chain Reaction? PCR Explained (شهر نوفمبر 2022).