معلومة

1.1: تقديم المشروع الصغير لمستشعر المضادات الحيوية البكتيرية - علم الأحياء

1.1: تقديم المشروع الصغير لمستشعر المضادات الحيوية البكتيرية - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تعد مقاومة المضادات الحيوية مشكلة ناشئة في الطب الحديث: 70٪ من السلالات البكتيرية تقاوم مضادًا حيويًا واحدًا على الأقل ، مما يجعل علاج الالتهابات البكتيرية الشائعة أمرًا صعبًا بشكل متزايد. نتيجة لذلك ، يموت في الولايات المتحدة عدد أكبر من الناس بسبب الالتهابات البكتيرية أكثر من عدوى فيروس العوز المناعي البشري وسرطان الثدي مجتمعين. خلال مسار المشروع الصغير ، ستتعرف على هذه المشكلة المهمة أثناء الحصول على خبرة عملية مع مجموعة متنوعة من التقنيات المستخدمة حاليًا في الإعدادات الأكاديمية والبحثية: المعلوماتية الحيوية ، والطفرات الموجهة من الموقع ، وتقنيات التلاعب بالأحماض النووية ومقايسات الربط الفلورية . تستخدم جميع تجاربنا كائنًا نموذجيًا غير ضار ؛ لذلك ، لا يوجد خطر من الإصابة.

1.1 ما هي المضادات الحيوية؟

الاكتشاف العرضي للسير ألكسندر فليمنج أن العفن البنسليوم نوتاتوم يمكن أن تدمر مستعمرات المكورات العنقودية الذهبية (STAPH) أدى إلى واحد من أعظم الاختراقات في الحرب ضد الأمراض المعدية - اكتشاف المضادات الحيوية. المضادات الحيوية المتاحة تجارياً هي مركبات طبيعية معدلة. غالبًا ما تأتي سقالات المضادات الحيوية من المضادات الحيوية الطبيعية التي تنتجها بكتيريا التربة (التتراسيكلين والستربتومايسين) أو الفطريات (البنسلين). تصنع البكتيريا المضادات الحيوية لسببين مختلفين بشكل واضح. أولاً ، تعمل المضادات الحيوية عند التركيز المنخفض كجزيئات إشارات تنظم توازن المجتمعات الميكروبية ، وقد تحفز بالفعل نمو الخلايا. في هذا السياق ، تلعب المضادات الحيوية دورًا في الاتصال من خلية إلى أخرى ، والمعروف أيضًا باسم استشعار النصاب ، وتنسيق نمو الخلايا داخل المجتمع البكتيري. ثانيًا ، تعد المضادات الحيوية بتركيزات عالية عوامل حرب ميكروبية: ينتجها نوع من البكتيريا لقتل نوع آخر. حتى الآن ، هناك 160 صنفًا معروفًا من المضادات الحيوية ؛ تم اكتشاف معظمها بين عامي 1940 و 1960.

تمارس المضادات الحيوية وظيفتها العلاجية من خلال استغلال الاختلاف في تخليق البروتين بين البكتيريا وحقيقيات النوى. المضاد الحيوي المستهدف لمستشعر السموم الذي ندرسه هو التتراسيكلين (الشكل 1.1). التتراسيكلين هو مركب عطري متعدد الحلقات يوقف تخليق البروتين في البكتيريا بينما يترك تخليق البروتين للكائن الحي غير متأثر. ونتيجة لذلك ، تقتل المضادات الحيوية التيتراسيكلين البكتيريا دون الإضرار بالمريض. أحد مشتقات التتراسيكلين الموصوفة بشكل شائع هو الدوكسيسيكلين ، ويستخدم لعلاج أمراض اللثة ، والتهابات المسالك البولية ، والكلاميديا ​​والسيلان ، من بين الالتهابات البكتيرية الأخرى.

1.2 ما هي مقاومة البكتيريا للمضادات الحيوية؟

مقاومة المضادات الحيوية البكتيرية هي قدرة البكتيريا المسببة للأمراض على مقاومة العلاج بمضادات الميكروبات مثل المضادات الحيوية. تشكل مقاومة المضادات الحيوية تهديدًا خطيرًا للصحة العالمية ، لأنها تعرض للخطر علاج عدد متزايد من العدوى التي تسببها البكتيريا أو الفطريات أو الفيروسات. وفقًا لمنظمة الصحة العالمية في عام 2012 ، كان هناك حوالي 450.000 حالة جديدة من السل المقاوم للأدوية المتعددة. تم التعرف على مرض السل المقاوم للأدوية على نطاق واسع في 92 دولة. تنتشر مقاومة الأدوية المضادة للملاريا من الجيل السابق على نطاق واسع في معظم البلدان الموبوءة بالملاريا. توجد نسب عالية من مقاومة البكتيريا للمضادات الحيوية التي تسبب التهابات شائعة (مثل التهابات المسالك البولية والالتهاب الرئوي والتهابات مجرى الدم) في جميع مناطق العالم. تحدث نسبة عالية من العدوى المكتسبة من المستشفيات بسبب بكتيريا شديدة المقاومة ، مثل البكتيريا المقاومة للميثيسيلين (MRSA) ، أو البكتيريا سالبة الجرام المقاومة للأدوية المتعددة. قد يصبح مرض السيلان قريبًا غير قابل للعلاج ، لأنه تم الإبلاغ عن فشل العلاج باستخدام أدوية الجيل الثالث من 10 دول ولا توجد لقاحات أو عقاقير جديدة قيد التطوير. يتعرض المرضى المصابون بمسببات الأمراض المقاومة للأدوية لخطر متزايد من حدوث نتائج سريرية أسوأ (حتى الموت) ، ويتطلبون عمومًا موارد رعاية صحية أكثر مقارنةً بالمرضى المصابين بسلالة غير مقاومة للأدوية. يقدر مركز السيطرة على الأمراض أن التكاليف المباشرة المرتبطة بعدوى المستشفيات تصل إلى 45 مليار دولار كل عام. مع ظهور سلالات بكتيرية مقاومة للعديد من العلاجات ، هناك حاجة ملحة لفهم كيفية تشغيل آليات الدفاع البكتيرية في وجود المضادات الحيوية.

تظهر مقاومة البكتيريا للمضادات الحيوية لثلاثة أسباب. (1) أصبحت المضادات الحيوية العلاج المناسب للعدوى وغالبًا ما يتم وصفها دون داع. (2) لا ينتهي المرضى في بعض الأحيان من وصفاتهم الطبية ، لكن يتوقفون عن تناول المضاد الحيوي بمجرد أن يشعروا بالتحسن. في هذه الحالة ، يتم إيقاف العلاج قبل القضاء على العدوى تمامًا مما يؤدي إلى انتشار البكتيريا المقاومة. (3) للبكتيريا قدرة جوهرية على الازدهار في البيئات السامة من خلال أن تصبح مقاومة لهذه السموم.

كيف تصبح البكتيريا مقاومة للمضادات الحيوية؟ توجد أربع آليات مختلفة يمكن من خلالها للبكتيريا أن تصبح مقاومة للمضادات الحيوية (الشكل 1.2). (أ) قد تتحلل البكتيريا أو تغير المضاد الحيوي. مثال على هذه الاستراتيجية هو إنتاج إنزيم بيتا لاكتاماز الذي يحط من المضادات الحيوية لعائلة البنسلين. (ب) قد تخضع البكتيريا للطفرات وتغير هدف المضاد الحيوي. ومن الأمثلة الجيدة على ذلك المضادات الحيوية التي تمارس وظيفتها من خلال الارتباط المباشر بالريبوسوم وبالتالي إيقاف الترجمة البكتيرية. بمجرد تحور الجزء ذي الصلة من الريبوسوم ، لا يمكن للمضاد الحيوي الارتباط به ولم يعد علاجًا ناجحًا ضد تلك البكتيريا. (ج) يمكن منع المضاد الحيوي من دخول الخلية. عادة ما تكون المتفطرة أكثر مقاومة للعلاج ، لأن غلافها الخلوي الشمعي يمنع دخول المضادات الحيوية. (د) يمكن إزالة المضادات الحيوية من الخلية بمساعدة مضخات التدفق. مضخات التدفق هي بروتينات غشائية متكاملة تضخ السموم خارج الخلية. فهي إما خاصة بدواء واحد أو تضخ عدة أدوية من البكتيريا. النوع الأخير يسمى مضخة تدفق مقاومة الأدوية المتعددة أو مضخة MDR. ينظم مستشعر السموم الذي تمت دراسته في المشروع الصغير التعبير عن مضخة تدفق MDR في العصوية الرقيقة. تم العثور على نظائر المستشعر في العديد من البكتيريا موجبة الجرام.

1.3 كيف تكتشف البكتيريا المضادات الحيوية في بيئتها؟

مثلما نفعل - تمتلك البكتيريا أجهزة استشعار لاكتشاف المركبات السامة. بمجرد أن تكتشف هذه المستشعرات مضادًا حيويًا ، فإنها تطلق تعبيرًا عن بروتين يجعل المضاد الحيوي غير فعال كعلاج باستخدام إحدى الآليات الأربع التي تمت مناقشتها أعلاه. عادةً ما تكون مستشعرات السموم في البكتيريا عبارة عن بروتينات (عوامل نسخ) ترتبط بالسم على وجه التحديد. ثم يرتبط معقد بروتين مستشعر السموم بالحمض النووي البكتيري أو الرنا المرسال لتنظيم التعبير عن الجين المقاوم الذي يجعل المضاد الحيوي غير ضار بالبكتيريا.

في المقابل ، فإن المستشعر الذي تمت دراسته في المشروع المصغر هو في الواقع جزيء RNA: مستشعر ykkCD RNA من العصوية الرقيقة. يتم ترميز مستشعر ykkCD في الحمض النووي للبكتيريا بجوار مضخة التدفق المقاومة للأدوية المتعددة والتي تسمى أيضًا ykkCD. يتعرف مستشعر ykkCD بشكل خاص على المضاد الحيوي التتراسيكلين. يرتبط مستشعر السموم ykkCD بالتتراسيكلين المضاد الحيوي. التتراسيكلين سام للبكتيريا وهو يجند لمضخة التدفق. يتم تنظيم التعبير عن مضخة التدفق بواسطة مستشعر ykkCD. يبدأ ارتباط التتراسيكلين بتغيير هيكلي في الرنا المرسال. يتيح هذا التغيير الهيكلي نسخ وترجمة جين مضخة التدفق الذي بدوره يضخ التتراسيكلين خارج الخلية البكتيرية. نتيجة لذلك ، لا يمكن أن يكون المضاد الحيوي التتراسيكلين فعالًا كعلاج ضد البكتيريا التي تحتوي على مستشعر السموم ykkCD أو متماثله. وبالتالي ، فإن البكتيريا التي تحتوي على مستشعر السموم ykkCD تقاوم التتراسيكلين.

1.4 كيف يمارس مستشعر ykkCD وظيفته؟

مستشعر ykkCD RNA هو مفتاح ريبوس. المحولات الريبية هي عناصر محفوظة في الرنا المرسال تنظم التعبير الجيني عن طريق التغييرات الهيكلية الخيفية. تقع في المنطقة غير المترجمة 5 (5’UTR) من الجين الذي ينظمونه. تعمل معظم المحولات الريبية التي تميزت حتى الآن على إيقاف التعبير عن الجين المنتج للأيض بمجرد تصنيع كميات كافية من المستقلب. عندما يصل تركيز المستقلب إلى عتبة ، فإنه قادر على الارتباط بالمحول الريبي وبدء تغيير هيكلي في mRNA الذي يمنع التعبير عن الجين المنتج للمستقلب إما عن طريق إيقاف النسخ أو منع تخليق البروتين. يتمثل الاختلاف الرئيسي بين تنظيم التعبير الجيني عن طريق المحولات الريبية والتنظيم بواسطة عوامل النسخ في أن المحولات الريبية هي جزء من mRNA وقادرة على الارتباط مباشرة بالرابط المستهدف دون مساعدة عامل البروتين المساعد. كيف يخضع مستشعر ykkCD لتغيير هيكلي عند ربط التتراسيكلين ويوجه التعبير عن مضخة التدفق ykkCD؟ (أ) في حالة عدم وجود التتراسيكلين ، يطوي مستشعر ykkCD RNA في هيكل يحتوي على جذع فاصل. يمنع هذا الجذع تخليق ykkCD تدفق مضخة مرنا. نتيجة لذلك ، لم يتم تصنيع مضخة التدفق. (ب) في وجود التتراسيكلين ، يطوي مستشعر الحمض النووي الريبي ykkCD في هيكل لا يحتوي على جذع المنهي. نتيجة لذلك ، يتم تصنيع مضخة التدفق ykkCD وقادرة على ضخ التتراسيكلين خارج الخلايا (الشكل 1.3).

1.5 ماذا نفعل خلال المشروع الصغير؟

يمنحك المشروع الصغير طعمًا لأبحاث الحياة الواقعية القائمة على الفرضيات ويقدم لك مشكلة مهمة جدًا في الكيمياء الحيوية: كيف تتعرف الجزيئات الكبيرة على الترابط الخاص بها. الإنزيمات والناقلات والمستقبلات كلها مطلوبة لتمييز هدفها المحدد عن الجزيئات الأخرى. يحققون ذلك من خلال تكوين روابط غير تساهمية محددة (روابط H ، أزواج أيونية و / أو تفاعلات فان دير فال) مع هدفهم. الجزيء الكبير قادر على تكوين تفاعلات غير تساهمية مع الهدف أكثر من الجزيئات الأخرى ، وبالتالي ، يكون المركب بين الجزيء الكبير وهدفه (المركب المشابه) أقل في الطاقة (ثابت التفكك المنخفض [Kد]) من المركب بين الجزيء الكبير والجزيئات الأخرى (المركب غير المتشابه). وبالتالي ، يتم رفض الجزيئات غير المحددة ، لأنها لا تستطيع تكوين جميع التفاعلات غير التساهمية المطلوبة. تم توضيح استراتيجية الاختيار هذه في المخطط أدناه (الشكل 1.4).

عادةً ما يلزم فقط مجموعة فرعية من النيوكليوتيدات أو الأحماض الأمينية في المستشعر للتعرف على الهدف المحدد. كيف نعرف أي جزء من الجزيء مطلوب للتعرف على الهدف؟ عادة ، يتم حفظ جزء من الجزيء الضخم الضروري للتعرف عليه من الناحية التطورية. هذا يعني ، إنها استراتيجية بحث شائعة لتحديد العناصر الموجودة في الجزيء الكبير المحفوظة طوال التطور ، وتغيير هذه العناصر باستخدام الطفرات الموجهة بالموقع واختبار ما إذا كان الجزيء الكبير المتحور يحتفظ بقدرته على التعرف على الترابط المستهدف عن طريق إجراء فحوصات ملزمة. إذا كان الجزيء المتحول لا يزال قادرًا على التعرف على الترابط المستهدف ، فمن المرجح أن المناطق التي تم تغييرها لم تكن ضرورية للتعرف على الهدف. في المقابل ، إذا لم يعد الجزيء المتحول قادرًا على التعرف على هدفه ، فمن المحتمل أن تكون المنطقة المتغيرة مهمة للتعرف عليها.

في المشروع المصغر ، ستبدأ في فهم الأساس الجزيئي لكيفية التعرف على أجهزة استشعار السموم على هدفها بشكل أفضل. في هذه العملية سوف تتعلم أحدث التقنيات (المدرجة بين قوسين في المخطط أدناه). تستخدم هذه التقنيات بشكل روتيني في مختبرات الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية في الصناعة والأوساط الأكاديمية. لتحديد أي جزء من مستشعر ykkCD ضروري للتعرف على التتراسيكلين ، سوف نتبع المخطط التفصيلي أدناه:

  • (1) تحديد العناصر الموجودة داخل مستشعر السموم والتي لم تتغير خلال التطور (محاذاة التسلسل والتنبؤ بالهيكل).
  • (2) تعديل هذه العناصر باستخدام الطفرات الموجهة للموقع (التصميم التمهيدي و PCR).
  • (3) تجميع أجهزة الاستشعار المعدلة (المتحولة). تتضمن هذه العملية عدة خطوات:
    1. توليف DNA البلازميد الذي يحتوي على تسلسل الحمض النووي الريبي المستشعر المتحور (إعداد البلازميد)
    2. قطع إنزيمي لهذا البلازميد DNA (هضم التقييد)
    3. في المختبر تخليق جهاز الاستشعار (نسخ الحمض النووي الريبي)
    4. تنقية RNA الاستشعار متحولة
  • (4) قم بتقييم ما إذا كان هذا الجزء من مستشعر السموم الذي اخترت تغييره ضروريًا للتعرف على التتراسيكلين أم لا (اختبار الربط الفلوري). إذا كان المستشعر المتحور لا يزال مرتبطًا بقوة بالتتراسيكلين (منخفض Kد القيمة) فإن المناطق التي تم تحورها لم تكن على الأرجح مهمة للتعرف عليها. وبالمثل ، إذا لم يعد المستشعر المتحور مرتبطًا بقوة بالتتراسيكلين ، فمن المحتمل أن تكون المناطق المتغيرة مهمة للتعرف على التتراسيكلين (ارتفاع Kد القيمة). يتم توضيح عملية التفكير هذه الشكل 1.5:

مخطط انسيابي للمشروع الصغير هو كما يلي:

ملاحظة للمدرس

تم تصميم الفصل الأول ليكون بمثابة مقدمة للمشروع المصغر لمقاومة المضادات الحيوية. تم تنفيذ هذا المشروع في ثماني جلسات معملية استمرت كل منها 3 ساعات. يُنصح بإلقاء محاضرة تمهيدية قبل بداية الجزء الذي مدته ثمانية أسابيع حتى يكون الطلاب على دراية بالمشروع قبل الشروع فيه. يمكن دمج المحاضرة التمهيدية بشكل ملائم مع تسجيل الوصول و / أو التدريب على السلامة الذي يحدث غالبًا عندما تلتقي المعامل الجامعية في المرة الأولى.


شاهد الفيديو: مشروع الاحياء 1 اولى ثانوي مسارات البكتيريا (قد 2022).