معلومة

المسح بالليزر المتحد البؤر للخلايا الحية Hela - توصيات للحصول على الفلوروفور الجيد الذي سيظهر حركة جيدة

المسح بالليزر المتحد البؤر للخلايا الحية Hela - توصيات للحصول على الفلوروفور الجيد الذي سيظهر حركة جيدة



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لقد كنت أقوم بالكثير من تصوير الخلايا الحية مؤخرًا باستخدام خلايا hela التي تعبر عن بعض البروتينات الكيميرية القائمة على EYFP. أقوم ببناء مكتبة فيديو لطالب فنون هنا في الجامعة الذي سينشئ معرضًا باستخدام مقاطع الفيديو. أحتاج إلى الكثير من المحتوى لجعل هذا ناجحًا ، وبدلاً من طلب الكثير من المزايا العلمية ، يجب أن تكون مقاطع الفيديو هذه "مشغولة" وأن تبدو جيدة. أنا أبحث عن اقتراحات بشأن أي صبغات أو فلوروفورات ، أو علاجات دوائية أو ظروف عمل شخص ما والتي ستظهر حركة / تغيرًا ملحوظًا في الخلية ، وتغيرًا في التوطين داخل الخلايا ... تغيير للخلية.

ما زلت حقًا أقوم بتحسين النظام باستخدام CO₂ وما إلى ذلك ... وأطول عملية شراء قمت بها هي حوالي 8 ساعات - بعد ذلك إما أن الخلايا ميتة أو يصبح الانجراف البؤري مشكلة كبيرة. آمل أن أرى بعض التقسيم بمجرد أن أتمكن من تسجيل النظام لفترة كافية. حتى ذلك الحين كان يبحث عن بعض الاقتراحات بشأن الاحتمالات الأخرى.

تشمل الأصباغ المختلفة التي استخدمتها: hoechst و dapi و mito-tracker و draq5 و er-red و rox-red. أيضا eyfp / tubulin، eyfy / mito، eyfp / golgi، draq5. هذه الأصباغ ليست رخيصة وأنا أعلم أنني أفعل ذلك لذلك أنا أتحقق هنا.


يبدو MitoSOX رائعًا جدًا. لم أستخدمها بنفسي مطلقًا ، لكنني متأكد من أنه يمكنك رؤية بعض ديناميكيات الميتوكوندريا الرائعة مستمرة. إنه باهظ الثمن بعض الشيء ، لكن كل الأصباغ ستكون.

حتى في 8 ساعات فقط من المحتمل أن تكون قادرًا على رؤية بعض الانقسامات ، والتي ستكون رائعة مع الصخب.


يعتبر السيستين (Cys) ، كأحد المركبات الحيوية في الكائنات الحية ، مشاركًا مهمًا في العملية الفسيولوجية والمرضية. ومع ذلك ، فإن مراقبة Cys الذاتية في الكائنات الحية لا تزال تعيقها بسبب عدم وجود مسبار الفلورسنت الفعال ذي الخصائص الفيزيائية الضوئية الممتازة. لذلك ، في هذا العمل ، حاولنا تطوير مجسات فلورية ممتازة لاكتشاف Cys بهدف تحسين الخصائص الفيزيائية الضوئية للفلوروفورات. أولاً ، من خلال التعديل الهيكلي العقلاني لـ dicyanoisophorone fluorophore عن طريق إدخال مجموعات بديلة مختلفة تسحب الإلكترون أو تتبرع بالإلكترون ، وجدنا أن ثلاثة فلوروفور مع مجموعة بدائل سحب الإلكترون (-F ، -Cl ، -Br) أظهرت انخفاضًا ملحوظًا في قيمة pKa وسلوك نزع البروتون الكامل في درجة الحموضة الفسيولوجية ، مما يمنح الفلوروفور انبعاث مضان قوي في حالة فسيولوجية وقدرة واسعة على التكيف مع درجة الحموضة. بعد ذلك ، قمنا بتطوير ثلاثة مجسات فلورية (F-Cys, Cl-Cys, Br-Cys) للكشف عن Cys عن طريق إدخال مجموعة الأكريلات كوحدة التعرف في هذه الفلوروفورات الثلاثة ، على التوالي. من خلال التقييم الشامل لأداء الاستشعار لثلاثة مجسات تجاه Cys ، قمنا بفحص أفضل مسبار الفلورسنت Br-Cys. في الحل ، Br-Cys أظهر حساسية عالية (حد الكشف: 86.9 نانومتر) ، استجابة سريعة (10 دقائق) ، تعزيز مضان كبير (214 ضعفًا) ، انتقائية جيدة ، وتكيف واسع مع درجة الحموضة. علاوة على ذلك ، Br-Cys تم توظيفه بنجاح في المراقبة المحددة لـ Cys في الخلايا والفئران ، مما يوفر أداة محتملة لفهم الوظائف الفسيولوجية والمرضية لـ Cys في الأنظمة الحية.

مسبار الفلورسنت ل في الجسم الحي الكشف عن Cys بناءً على التصميم العقلاني للديسيانو أيزوفورون من خلال استراتيجية خفض pKa.


مقدمة

يمكن اعتبار استخدام إيرليش للأصباغ الاصطناعية كوسيلة لتلطيخ العينات البيولوجية كأحد أحجار الأساس للبحث العلمي الحديث. بعد قرن من الزمان ، غالبًا ما يكون استخدام التصوير الفلوري كتقنية لتصور مناطق محددة من الخلايا الحية 1،2،3،4 أو الكائنات الحية الكاملة 5،6 محوريًا لبرامج البحث ، مع ظهور تطبيقات إكلينيكية مثل الجراحة الموجهة بالفلور 7،9،10،11.

تتمثل أوجه القصور الرئيسية في التصوير الفلوري باستخدام الفلوروفورات الجزيئية في التداخل من التألق الخلفي غير المحدد خارج منطقة الاهتمام (ROI) ، وعدم كفاية الثبات الضوئي والسمية الخلوية. يستلزم ضعف انتقائية العائد على الاستثمار (ROI) تأخيرًا زمنيًا للسماح بإزالة الفلوروفور الخلفية و / أو إجراء غسيل بين إدارة الفلوروفور والحصول على الصورة. يمكن أن يقصر هذا التصوير على الخلايا الثابتة أو اللقطات الثابتة ، دون إمكانية الحصول على البيانات بشكل مستمر طوال التجربة. يتمثل أحد الأساليب المبتكرة لتعزيز نسبة إشارة الهدف إلى الخلفية في استغلال آلية إخماد الفلورة الانتقائي في مناطق الخلفية ، مع إنشاء إمكانات انبعاث الفلوروفور فقط في عائد الاستثمار 12،13. قد يصبح التسجيل المستمر للأحداث الخلوية الديناميكية في الوقت الحقيقي ممكنًا إذا كان تبديل التألق للتشغيل / الإيقاف قابلاً للعكس.

يطرح تطوير حامل الفلوروفور سريع الاستجابة المناسب لتصوير الخلايا الحية في الوقت الحقيقي سلسلة من التحديات. المعايير الصارمة مطلوبة ، مثل انتقائية الاستجابة شبه المثالية ، واستقرار ضوئي استثنائي ، وسمية منخفضة للظلام والضوء. الحصول على استجابات مضان انتقائية للتحليلات داخل الخلايا ليس بالأمر الهين ، حيث أن انتقائية التحليلات التي لوحظت في بيئة متجانسة مضبوطة من الكوفيت لا تُترجم بالضرورة إلى أكثر تعقيدًا بكثير في المختبر أو في الجسم الحي الإعدادات. يضع التصوير المستمر للخلايا الحية متطلبات عالية جدًا على الثبات الضوئي للفلوروفور ، حيث يتم تصوير نفس الخلية (الخلايا) بشكل متكرر بمرور الوقت. يجب أن تكون سمية الفلوروفور الداكنة منخفضة ، بحيث لا يتم المساس بقدرة الخلية على البقاء والعمليات الخلوية الطبيعية غير مضطربة. لتقليل السمية التي يسببها الضوء ، يفضل استخدام أطوال موجية منخفضة الطاقة في المنطقة الطيفية للأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) (λ= 700-900 نانومتر). ل في الجسم الحي التصوير ، واستخدام NIR fluorophores ضروري. هذه المنطقة الطيفية مطلوبة لنقل الضوء بشكل فعال من خلال أنسجة الجسم ، حيث توجد مستويات منخفضة من الامتصاص والتشتت في هذه الأطوال الموجية الأطول وأقل تألق ذاتي جوهري. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان من الممكن تحقيق تشغيل / إيقاف تشغيل تبديل مضان NIR في الجسم الحي، ثم يمكن الحصول على مزايا تصوير مماثلة مثل في-المختبر التصوير الخلوي.

حاليًا ، هناك مجموعة صغيرة ولكنها متزايدة من فئات NIR fluorophore ولكنها غالبًا ما تعاني من عدم كفاية الثبات الضوئي وتفتقر إلى أطوال موجات الانبعاثات التي تزيد عن 700 نانومتر 14. أدى تركيزنا البحثي الأخير إلى تطوير BF2- فئة أزاديبيروميثين ذات الصلة 1 (الشكل 1) 15،16،17،18. هذه الفئة سهلة التركيب نسبيًا وقابلة للتطوير الهيكلي وتعرض خصائص فيزيائية ضوئية ممتازة. على سبيل المثال ، المشتق 1 (R = Ph) له امتصاص / انبعاث λالأعلى عند 696 و 727 نانومتر في المحاليل المائية ، وعوائد كمية عالية من التألق (0.3-0.4) واستقرار ضوئي ممتاز 17. ومع ذلك ، على الرغم من التقدم الأخير ، لا تزال هناك حاجة كبيرة لفلور جزيئي NIR جزيئي جديد أكثر تعقيدًا يستجيب داخل الخلايا ، والذي يمكن استخدامه لتصور العمليات الخلوية الديناميكية في الوقت الحقيقي مع إمكانية في الجسم الحي ترجمة.

الهيكل العام لـ BF2-آزاديبيروميثين 1. تصميم وتوليف BF المستجيب للجسيمات2- أزاديبيروميثين فلوروفور 2.

كان الهدف من عملنا الحالي هو تطوير NIR fluorophore قادرًا على استجابة مضان ناتجة عن الليزوزومات ، وبالتالي السماح بالتصوير في الوقت الفعلي لامتصاص الخلايا والاتجار بها وتدفقها دون الإخلال بوظيفة 19. يعتبر الالتقام الخلوي ، العملية التي يتم من خلالها استيعاب الخلايا للجزيئات الحيوية ، أمرًا شائعًا لجميع الخلايا وتمثل مجالًا مهمًا من مجالات الاهتمام البحثي بسبب العمليات البيولوجية العديدة المرتبطة بها. تحافظ العضيات المشاركة في كل مرحلة من مسار الالتقام الخلوي على درجة حموضة فريدة داخل المثانة / موضعية ، لتوفير الظروف المناسبة لعمليات كيميائية حيوية محددة. على الرغم من أن المناطق خارج الخلية والعصارة الخلوية عند درجة الحموضة ∼ 7.2 ، فإن الجسيمات الحالة أكثر حمضية بشكل ملحوظ. على طول مسار الالتقام ، ينخفض ​​الرقم الهيدروجيني من 6.3 في الجسيمات الداخلية المبكرة حتى ∼ 5.5 في الجسيمات الداخلية المتأخرة ، وصولاً إلى 4.5 في الجسيمات الحالة (الشكل 2). على هذا النحو ، يوجد فرق ما يقرب من ثلاثة أوامر من حيث الحجم في تركيز البروتون بين داخل الليزوزوم وخارج الخلية ، وهو ما يكفي لإنشاء مشغل انتقائي للتبديل الفلوري 23،24،25،26. ومع ذلك ، لا يزال هناك تحد كبير في انتقائية الاستجابة الإضافية ، حيث يمكن أن تكون الفلوروفورات الجزيئية المستجيبة للأس الهيدروجيني أيضًا مستجيبة لقطبية البيئة الدقيقة ، والتي يمكن أن تعرض استخدامها في التجارب الخلوية للخطر (فيديو تحت).

(أ) الالتقام الخلوي المبسط للفلوروفور NIR المستجيب. تمثل الأرقام الرقم الهيدروجيني التقريبي للعضيات المقابلة. (ب) ثلاث مراحل يمكن ملاحظتها من مسار الفلوروفور المستجيب للأس الهيدروجيني في البيئة الخلوية: الامتصاص والاتجار والتدفق.

تم توضيح تصميم المجس المستجيب للجسيمات الليزوزومية الجديد في الشكل 1 حيث يتم تفعيل النواة الفلورية (الصندوق البرتقالي) باستخدام أورثو- تم اختيار مجموعة النيترو الفينول لإضفاء ميزة استجابة الأس الهيدروجيني للمسبار. من المتوقع أن ينسحب الإلكترون ا- ستؤدي مجموعة النيترو إلى سيطرة الفينولات المتأينة عند درجة الحموضة 7.2 ، مما يؤدي إلى إخماد مضان بسبب حالة نقل شحنة داخل الجزيء غير انبعاثية (الشكل 1 ، المربع الرمادي). بعد الامتصاص الخلوي عن طريق الالتقام الخلوي والتقسيم إلى عضيات حمضية مثل الجسيمات الحالة ، سيحدث البروتون مع إعطاء أنواع الفينول المحايدة وسيتم إنشاء إشارة انبعاث NIR (الشكل 1 ، المربع الأحمر). هذا النهج هو خروج كبير عن البقع الليزوزومية الأخرى ، التي تعتمد على بروتون أمين لتكوين ملح أمونيوم موجب الشحنة لتركيز الفلوروفور في الأجزاء الحمضية. تشتمل ميزة التصميم الإضافية المهمة على بوليمر بولي إيثيلين جلايكول (PEG) مرتبط تساهميًا لتوفير قابلية الذوبان المائي وتعزيز الامتصاص الخلوي عبر مسارات الالتقام (الشكل 1 ، المربع الأزرق).


مسح ليزر متحد البؤر للخلايا الحية من هيلا - توصيات للحصول على الفلوروفور الجيد الذي سيظهر حركة جيدة - علم الأحياء

يستخدم عدد متزايد من التحقيقات تقنيات التصوير بالخلايا الحية لتوفير نظرة ثاقبة على الطبيعة الأساسية للوظيفة الخلوية والأنسجة ، خاصة بسبب التطورات السريعة التي نشهدها حاليًا في البروتين الفلوري وتقنية الفلوروفور الاصطناعية. بسبب هذه التطورات ، أصبح تصوير الخلايا الحية أداة تحليلية ضرورية في معظم مختبرات بيولوجيا الخلية ، بالإضافة إلى منهجية روتينية تُمارس في مجالات واسعة النطاق من علم الأحياء العصبية ، وعلم الأحياء التطوري ، وعلم العقاقير ، والعديد من تخصصات البحوث الطبية الحيوية الأخرى ذات الصلة . من بين أهم التحديات التقنية لإجراء تجارب تصوير الخلايا الحية الناجحة هو الحفاظ على الخلايا في حالة صحية وتعمل بشكل طبيعي على مرحلة المجهر أثناء الإضاءة في وجود الفلوروفورات الاصطناعية و / أو البروتينات الفلورية.

شكل 1 - تصوير الخلايا الحية بالبروتينات الفلورية و DIC

يعد التحكم الصارم في البيئة أحد أهم العوامل في نجاح تجارب التصوير بالخلايا الحية. على وجه الخصوص ، فإن الظروف التي يتم فيها الحفاظ على الخلايا في مرحلة الميكروسكوب ، على الرغم من اختلافها على نطاق واسع في العديد من المتطلبات اعتمادًا على الكائن الحي ، غالبًا ما تملي نجاح أو فشل التجربة. تشمل جوانب البيئة التي يتم التلاعب بها بسهولة المعلمات الفيزيائية للغرفة التي تنمو فيها الخلايا وتصويرها ، والدرجة الموضعية للتحكم في درجة الحرارة ، والظروف الجوية (خليط الغاز والرطوبة) ، والمكملات الغذائية ، ووسط النمو المؤقت (pH) ، وأسمولية وسط الثقافة.

يتضح في شكل 1 هي سلسلة من الصور التي تم التقاطها من عدة خطوط خلوية غير مرتبطة ، كل منها مُسمى بمجموعة مختلفة من الفلوروفورات الاصطناعية و / أو البروتينات الفلورية. خلايا أرنب الكلى الظهارية (RK-13 في الخط الشكل 1 (أ) تم نقل العدوى ببلازميد اندماج لبروتين أصفر فلوري محسن (EYFP) وببتيد إشارة الاستهداف النووي لتوطين علامة صفراء مخضرة في النواة. تمت معالجة الخلايا لاحقًا باستخدام MitoTracker Red CMXRos لتلطيخ الميتوكوندريا. في الشكل 1 (ب) ، الخلايا الظهارية للنبيبات القريبة من الأبوسوم (نعم الخط) باستخدام ناقل توطين خلوي EYFP-actin لتسمية شبكة الهيكل الخلوي الأكتين الخيطية. تم استهداف الميتوكوندريا بمتجه اندماج DsRed2 في خلايا Muntjac الهندية المقدمة في الشكل 1 (ج)، بينما يبرز البلازميد الخيمري EGFP-peroxisomal البيروكسيسومات في سرطان عنق الرحم البشري (هيلا line) في خلايا الشكل 1 (د). الثقافة الملتصقة بالخلايا الليفية الليفية الكلوية الهامستر الذهبي السوري الطبيعي (BHK-21 سطر) مميز الشكل 1 (هـ) تم نقل العدوى بمزيج من DsRed2 FP-endoplasmic network وناقلات التوطين تحت الخلوية EGFP-nucleus ، وبالتالي توطين علامة البروتين الفلوري الأخضر للنواة ومسبار برتقالي أحمر إلى الشبكة الإندوبلازمية. أخيرًا ، خلايا ساركوما العظام البشرية (U2OS سطر) يتضح في الشكل 1 (و) تم نقله ببروتين فلوريان فلوري مدمجًا في تسلسل استهداف الميتوكوندريا لتسمية الميتوكوندريا. لكل من الصور بتنسيق شكل 1، تم تسجيل قناة منفصلة باستخدام تباين التداخل التفاضلي وتراكبها على قناة (قنوات) الفلورة لتحديد حدود الخلية والميزات الهيكلية الشائعة الأخرى ، مثل النواة.

أثناء صياغة الخطط لملاحظات الخلايا الحية وتجارب التصوير طويلة المدى ، هناك عدد من العوامل المهمة التي تستحق الدراسة الجادة. يجب تمييز العينة بدقة بالبروتين الفلوري أو الفلوروفور الصناعي ذي الأهمية من أجل تصور المكونات البيولوجية المستهدفة بوضوح. ولعل الأهم من ذلك ، يجب الحفاظ على ثقافة الخلية في حالة تعزز النمو والوظيفة الطبيعية من أجل تجنب الآثار المحتملة في تفسير النتائج التجريبية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تصوير الخلايا بدقة مكانية وزمنية كافية بطريقة لا تحفز السمية الضوئية أو تزعج توطين المجسات الفلورية. من بين أهم الاعتبارات الروتينية لتصوير الخلايا الحية التي يجب معالجتها (ومناقشتها بالتفصيل أدناه انظر الجدول 1) هي درجة الحرارة ، والأكسجين ، والرطوبة ، والأسمولية ، ودرجة الحموضة (التخزين المؤقت المتوسط) ، والسمية الضوئية ، وبيئة المختبر ، وانجراف تركيز المجهر ، وقوة إشارة التألق ، والنزيف ، والدقة.

إن الحفاظ على الخلايا الحية في حالة صحية في مرحلة المجهر هو بلا شك الجانب الأكثر أهمية لأي تحقيق في تصوير الخلايا الحية ويتطلب عمومًا مزيجًا من البراعة الميكانيكية جنبًا إلى جنب مع نظرة ثاقبة لبيولوجيا الخلية أو الأنسجة التي تتم دراستها. على الرغم من أن العديد من المختبرات بارعة في زراعة الخلايا المستنبتة في حاضنات ثاني أكسيد الكربون التي يتم التحكم في درجة حرارتها ، إلا أن مهمة الحفاظ على الخلايا في مرحلة الميكروسكوب لإجراء تجارب التصوير طويلة المدى تتطلب أكثر بكثير. يجب أن تحافظ غرفة التصوير على عمل الخلايا (أو الأنسجة) بشكل طبيعي طوال مدة التجربة ، مع السماح بالوصول غير المقيد عن طريق هدف المجهر. يمكن أن يصبح هذا العمل الفذ صعبًا بشكل خاص عند استخدام زيت الفتحة الرقمية العالية أو أهداف الغمر في الماء. في كثير من الحالات ، يجب أن يكون المحقق قادرًا على إدخال كاشف أثناء التصوير (لإرباك عملية خلوية معينة) دون الإخلال بتسلسل الفاصل الزمني عن طريق تحويل التركيز أو موضع المرحلة. العوامل المهمة الأخرى هي البساطة والموثوقية والتكلفة المعقولة. تركز المناقشة التالية في المقام الأول على خلايا الثدييات ، لكن التقنيات الخاصة بمجموعة متنوعة من الكائنات الحية الأخرى تختلف قليلاً فقط وهي عادةً ليست صارمة. على سبيل المثال ، لا تتطلب مزارع الخميرة والحشرات والخلايا النباتية متطلبات درجة الحرارة الصارمة ، في حين أن تكوين الوسائط ليس مطلوبًا للخلايا البكتيرية.

وسائط الثقافة لخطوط الخلايا الثديية

على الرغم من أن وسائط المحاولات المبكرة في زراعة الخلايا والأنسجة تتكون من مخاليط تحتوي على مستخلصات الأجنة ، والمصل ، وهيدروزيلات البروتين ومجموعة من سوائل الجسم الأخرى ، يتطلب انتشار الخطوط الثابتة الانتقال بسرعة إلى وسائط محددة بناءً على المتطلبات الكيميائية الحيوية. من بين هؤلاء ، الأكثر شعبية هي Eagle's Basal (EBM) و Minimal Essential (MEM) وسائل الإعلام الثقافية ، تعديل Dulbecco لـ MEM (DMEM) ، وسائل إعلام حام (إف 10 و إف 12) ، واثنين من التركيبات عالية الدقة للوسائط المصممة في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI 1640 و RPMI 199). بالإضافة إلى ذلك ، وسيلة مصممة لاستنبات الخلايا في حالة عدم وجود عازلة بيكربونات (وثاني أكسيد الكربون) ، Leibovitz L-15، تم توظيفه على نطاق واسع. تتطلب كل وسائط الاستزراع هذه إضافة مصل (مشتق عادةً من عجول أو خيول الجنين وحديثي الولادة) إلى جزء حجم نهائي يتراوح بين 5 و 20 بالمائة. كما تم تطوير وسائط خالية من المصل لاستنبات خلايا عالية التخصص في ظل ظروف محددة بدقة تفيد التطبيقات في صناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية. غالبًا ما تتنازل العديد من المعامل التي تشارك في زراعة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في المتطلبات الصارمة لتركيبة دقيقة باستخدام مزيج من وسط معقد ، مثل Ham's F-12 ، مع وسيط ثانٍ (DMEM ، على سبيل المثال) يحتوي على نسبة أعلى من الأمينية تركيزات الحمض والفيتامينات.

يختلف تكوين وسائط زراعة الخلايا على نطاق واسع ، ولكن معظم الوصفات تشمل الأحماض الأمينية والفيتامينات والأملاح غير العضوية (المعادن) والعناصر النزرة ومكونات الحمض النووي (القواعد والنيوكليوسيدات) والسكريات والإنزيمات المشتركة والدهون ووسائط دورة حمض الكربوكسيليك الوسيطة و مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية الحيوية الأخرى. تحتوي الوسائط البسيطة ، مثل MEM ، على الأحماض الأمينية الأساسية والفيتامينات والأملاح فقط ، بينما تحتوي التركيبات الأكثر تعقيدًا (RPMI والوسائط الخالية من المصل) على مئات المكونات. عادة ما يتم تصميم وسائط زراعة الخلايا لأغراض محددة ، بما في ذلك النمو الروتيني لخطوط الخلايا الطبيعية والخالدة (المحولة) ، وبدء الثقافة الأولية ، وانتشار الفيروس ، والتحضير الصيدلاني ، وظروف النمو المحددة للمتغيرات الجينية. من بين المتغيرات التي يتم التحكم فيها في جميع تركيبات وسائط زراعة الأنسجة ، الأس الهيدروجيني ، وسعة التخزين المؤقت ، وتركيز الأكسجين ، والأسمولية ، واللزوجة ، والتوتر السطحي. عندما يتم تصوير الخلايا في المجهر ، حتى لفترات زمنية قصيرة ، يجب إعادة إنتاج نفس الظروف المتوسطة بعناية في نظام تصوير الخلايا الحية.

الجدول 1 - المتغيرات البيئية لخطوط خلايا الثدييات

عاملالمدى الأمثلتعليقات
درجة حرارة28-37 درجة مئويةالتحكم باستخدام سخانات غرفة العينة تستخدم سخانات الإرواء المضمنة سخانات العدسة الموضوعية صناديق التحكم البيئية
أكسجينعاملقم بإرواء أو تغيير الوسائط بانتظام استخدم حجم الغرفة الكبير
رطوبة97-100 بالمائةنظام الملء التلقائي للغرفة البيئية الرطبة المغلقة (المغلقة) للغرف المفتوحة
الرقم الهيدروجيني7.0-7.7استخدم HEPES Buffered Media Perfuse أو تغيير الوسائط بانتظام بدون مؤشر أحمر الفينول
الأسمولية260-320 شهرًاتجنب التبخر الغرفة المغلقة (مختومة) الغرفة البيئية المرطبة
الغلاف الجويالهواء أو 5-7 في المائة ثاني أكسيد الكربوناستخدم وسائط HEPES المخزنة للغرفة المغلقة (محكمة الغلق) للتحكم في جو الغرفة
الوسائط العازلةالبيكربونات أو المخازن البيولوجية الاصطناعيةاحذر من السمية الضوئية للغرف المغلقة والمفتوحة للتحكم في الغلاف الجوي

تنمو غالبية خطوط الخلايا الشائعة المستخدمة في تجارب التصوير بالخلايا الحية بشكل جيد جدًا في نطاق ضيق من الأس الهيدروجيني بين 7.2 و 7.4 ، على الرغم من أن بعض الخلايا الليفية العادية تعمل بشكل أفضل عند قيم درجة حموضة أعلى قليلاً (تصل إلى 7.7) ، في حين أن العديد من خطوط الخلايا المحولة تنمو بشكل أسرع في الأوساط الحمضية (وصولاً إلى درجة الحموضة 7.0). في الحالات التي يكون فيها الرقم الهيدروجيني مهمًا للدقة التجريبية ، يجب إجراء اختبار كفاءة الطلاء عند الرقم الهيدروجيني المستهدف لضمان أداء خط الخلية المحدد بشكل مرض. تحتوي معظم تركيبات الوسائط المتاحة تجارياً على صبغة مؤشر (عادةً الفينول الأحمر) لتحديد القيمة التقريبية للأس الهيدروجيني بالعين المجردة. في المحلول ، ينتج الفينول الأحمر صبغة حمراء ساطعة عند الرقم الهيدروجيني 7.4 ، ويصبح برتقاليًا عند درجة الحموضة 7.0 ، والأصفر عند درجة الحموضة 6.5 ، وهو تحول في اللون غالبًا ما يُلاحظ عندما يصبح الوسط أكثر حمضية لأن الثقافات تشكل طبقات أحادية متجمعة. عند قيم الأس الهيدروجيني الأعلى ، يتحول لون الفينول الأحمر إلى اللون الوردي عند درجة الحموضة 7.6 والأرجواني عند درجة الحموضة 7.8 وما فوق. تجد العديد من مختبرات زراعة الأنسجة أنه من المفيد إنشاء مجموعة من معايير الأس الهيدروجيني باستخدام الفينول الأحمر في محلول ملح متوازن بقيم أس هيدروجيني متفاوتة للمقارنة بوسائط الاستنبات. على الرغم من أن صبغة المؤشر ضرورية للثقافة الروتينية للخلايا ، نظرًا لارتفاع معامل الانقراض لامتصاص الضوء المرئي ، يجب تجنب استخدامها في تجارب التصوير الفلوري للخلايا الحية من أجل تقليل مستوى ضوضاء الخلفية ومنع السمية الضوئية. وإدراكًا لهذه الحقيقة ، يوفر المصنعون معظم تركيبات الوسائط الشائعة في شكل سائل أو مسحوق معقم بدون الفينول الأحمر.

تتطلب جميع خطوط الخلايا تقريبًا نظامًا عازلًا لثاني أكسيد الكربون وبيكربونات لتنظيم الأس الهيدروجيني ويجب تربيته في جو يحتوي على نسبة صغيرة من ثاني أكسيد الكربون (عادةً من 5 إلى 7 في المائة ، اعتمادًا على تركيز البيكربونات) في حاضنات متخصصة للتحكم الصارم في التركيز من الغاز المذاب. بالنسبة لتصوير الخلايا الحية على المجهر ، قد يكون إنتاج جو مناسب بثاني أكسيد الكربون أمرًا صعبًا وعادة ما يتطلب غرف زراعة مصممة خصيصًا لجو منظم. كان إدخال المحاليل الوقائية البيولوجية الاصطناعية ، مثل TRIS و HEPES ، ذا قيمة مشكوك فيها في القضاء على متطلبات ثاني أكسيد الكربون ، حيث أن العديد من خطوط الخلايا لن تتسامح مع نقص ثاني أكسيد الكربون ، خاصة في تركيزات الخلايا المنخفضة. بشكل عام ، يمكن أن يتحكم تركيز 10 إلى 20 ملي مولار من محلول HEPES في درجة الحموضة ضمن النطاق الفسيولوجي في حالة عدم وجود جو من ثاني أكسيد الكربون ، ولكن لا يزال يجب استكمال وسط المزرعة ببيكربونات الصوديوم لتحقيق النمو الأمثل للخلايا.

عادة ما تؤدي محاولة نمو الخلايا على المجهر باستخدام HEPES وحده إلى انخفاض معدلات النمو بشكل كبير (خاصة للتجارب طويلة المدى) ، ويجب فحص كل خط خلوي بعناية لقدرته على النمو والعمل في الوسائط بدون نظام عازلة لثاني أكسيد الكربون. لاحظ أن استكمال نظام عازلة البيكربونات في وسط زراعة الخلايا باستخدام HEPES يقلل فقط من معدل انجراف الأس الهيدروجيني ، ولا يلغي الزيادة التدريجية في القلوية التي تحدث عندما تتعرض المزرعة للجو. بالإضافة إلى ذلك ، ظهرت العديد من التقارير عن سمية HEPES أثناء تجارب التصوير بالخلايا الحية ، ويفترض أن ذلك يرجع إلى زيادة تكوين الجذور الحرة بواسطة المخزن المؤقت الاصطناعي في ظل ظروف الإضاءة المطلوبة لتصور تحقيقات الفلورسنت. تم تصميم تركيبة متخصصة ، وسيط Leibovitz L-15 ، للتخلص من ثاني أكسيد الكربون من خلال استخدام بيروفات الصوديوم والتخزين المؤقت بتركيزات عالية من الأحماض الأمينية. يسمح تضمين بيروفات الصوديوم في وسط الاستزراع للخلايا بزيادة إنتاجها الداخلي من ثاني أكسيد الكربون ، مما يجعلها من الناحية النظرية مستقلة عن الغاز (وكذلك البيكربونات). ومع ذلك ، فإن العديد من خطوط الخلايا لا تتكيف بشكل جيد مع وسط L-15 ويجب فحصها بدقة لعدة مقاطع قبل تكوين تجارب تصوير الخلايا الحية بناءً على هذه الصيغة.

يمكن أن تختلف خطوط الخلايا على نطاق واسع في احتياجاتها من الأكسجين ، على الرغم من أن مستويات التوتر الطبيعي للأكسجين في الغلاف الجوي ستلبي احتياجات معظم الثقافات. تتطلب خلايا الثدييات عادة الأكسجين للتنفس في الجسم الحي، ولكن يمكن في كثير من الأحيان أن يحل محل تحلل السكر (عملية لا هوائية) بنجاح عندما ينمو في أوعية الاستنبات كخطوط أولية أو بعد الخلود. يمكن أن يؤثر عمق وسط الاستزراع فوق الخلايا على معدل انتشار الأكسجين إلى الخلايا الملتصقة التي تنمو على سطح زجاجي أو بلاستيكي ويجب أن يظل أقل من 5 ملليمترات. في معظم حالات التصوير بالخلايا الحية ، لا يكون التنظيم الصارم للأكسجين ضروريًا ، وعلى العكس من ذلك ، غالبًا ما يستخدم استنفاد الأكسجين كإستراتيجية لتقليل التلف الضوئي أثناء الإضاءة الفلورية التي يمكن أن تحدث من خلال التفاعلات مع الجذور الحرة للأكسجين. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن خفض توتر الأكسجين يمكن أن يكون ضارًا بالخلايا إذا بدأت تعاني من الإجهاد الناجم عن نقص الأكسجين. تتضمن الطريقة الأكثر شيوعًا لخفض مستويات الأكسجين تطبيق نظام تجاري لاستنفاد الأكسجين ، مثل Oxyrase. تشمل التقنيات البديلة للحد من ضرر الجذور الحرة بسبب الأكسجين الجزيئي تكميل الوسيط بأدوات الزبال مثل أسكوربات (حمض الأسكوربيك وفيتامين ج) أو ترولوكس (أحد مشتقات فيتامين إي) ، ولكن يجب أن تكون استراتيجية تقليل شدة الإضاءة المقترنة بأنظمة الكاميرا شديدة الحساسية أيضا.

تتمتع معظم خطوط الخلايا الشائعة بتسامح واسع إلى حد ما مع الضغط الاسموزي وستنمو بشكل جيد في الأسمولية بين 260 و 320 ملي مولار. في الحالات التي تزرع فيها الخلايا بشكل روتيني في أطباق بتري أو مزارع الألواح المفتوحة ، يمكن استبدال الوسط ناقص التوتر للتعويض عن التبخر. من المهم مراقبة الأسمولية لوسط الاستزراع عند تغيير الدستور عن طريق إضافة المحاليل المنظمة العضوية أو عقاقير اختيار البلازميد ، مثل HEPES و G-418 ، على التوالي. سيتم تحديد تركيز الأيونات والمغذيات العضوية في تصوير الخلايا الحية مبدئيًا بواسطة الوسيط المختار للتجربة ، لكن الأحجام الصغيرة من الوسائط التي تستوعبها معظم غرف التصوير عرضة للتغييرات في الأسمولية بسبب التبخر (هذه المشكلة عادة ما تكون أكثر شديد عند تسخين الوسط إلى 37 درجة مئوية). لذلك ، يجب توخي الحذر عند تجميع الخلايا في غرف وعند تغيير وسط المزرعة إذا حدث أي تبخر (الخلايا حساسة للغاية للتغيرات السريعة في الأسمولية). بالإضافة إلى ذلك ، أثناء تجربة التصوير ، يجب تقليل التبخر إما عن طريق استخدام نظام مغلق ، أو عن طريق تغطية الوسط في غرفة مفتوحة بزيت أقل كثافة من الماء (عادة زيت معدني) ، أو عن طريق ترطيب الغرفة أثناء التصوير. . لاحظ أنه ، بشكل عام ، البيئة الدقيقة التي يوفرها الحجم الصغير في غرفة تصوير الخلايا الحية بطبيعتها أقل استقرارًا من حاضنة ثاني أكسيد الكربون وتتطلب مزيدًا من الاهتمام في كل التفاصيل.

اختيار خطوط الخلايا لتصوير الخلايا الحية

غالبًا ما يتم تحديد اختيار خط الخلية المستخدم في تجارب التصوير بالخلايا الحية (ومحدودًا) بعدد من العوامل ، بما في ذلك الملاحظات البيولوجية المستهدفة للتحقيق ، وقدرة الخلايا على تصنيفها باستخدام الفلوروفورات الاصطناعية ، وكفاءة تعداء الخلايا ، و تحمل خط خلية معين للظروف البيئية والإضاءة الصارمة لغرفة الثقافة. في كثير من الأحيان ، يؤدي خط الخلية الذي يعرض خصائص ممتازة في واحدة من أكثر من هذه الفئات أداءً هامشيًا أو يفشل تمامًا في فئة أخرى. على سبيل المثال ، الخلايا البطانية للشريان الرئوي البقري الطبيعي (BPAE الخط) ثابتًا وملطخًا باستخدام الفلوروفورات الاصطناعية للكشف عن التفاصيل الهيكلية الخلوية المعقدة بوضوح رائع ، ولكن لا يمكن نقل الخط إلا باستخدام نواقل البروتين الفلوري بكفاءة منخفضة (أقل من 5 في المائة) وهو غير متسامح نسبيًا مع الإضاءة طويلة المدى عند مستويات الإضاءة المنخفضة التي لا تؤثر على العديد من خطوط الخلايا الأخرى. بدلا من ذلك ، أرنب الكلى الخلايا الظهارية (RK-13 الخط) بكفاءة عالية مع مجموعة متنوعة من البلازميدات ومتسامح للغاية مع مستويات الإضاءة العالية (بما في ذلك ضوء الليزر) أثناء تسلسل الفاصل الزمني الممتد لعدة أيام ، ولكن لا يتم تلطيخه بشكل كافٍ بالعديد من الفلوروفورات الاصطناعية الشائعة (مثل مثل MitoTrackers) المصممة لتصوير الخلايا الحية.

العامل المهيمن في الملاحظة الناجحة للظواهر البيولوجية في الخلايا الحية هو أن الخط المعين المختار للدراسة والتصوير يجب أن يعرض الخصائص المورفولوجية والفسيولوجية اللازمة لإظهار مفهوم الاهتمام بوضوح. في الدراسات التي تستهدف الانقسام الفتيلي ، على سبيل المثال ، تكون العديد من خطوط الخلايا أقل من كافية للتصوير بسبب حقيقة أن الخلايا المنقسمة تصبح كروية وقد تنفصل عن الركيزة. بدلاً من ذلك ، فإن خطوط الخلايا التي تظل مسطحة نسبيًا ومتصلة بالركيزة أثناء الانقسام الفتيلي تكون أفضل بكثير في الكشف عن التفاصيل الدقيقة للمغزل الانقسامي أثناء انقسام الخلية. من بين الخطوط الأكثر فائدة لدراسات الانقسام الخيطي خلايا الكلى على شكل حيوان الكنغر (PtK1 و PtK2 السطور ، انظر الجدول 2) ، والتي لا يمكن نقلها إلا بكفاءة منخفضة نسبيًا ، ولكنها تحتوي على عدد صغير من الكروموسومات التي يسهل تمييزها في المجهر. العديد من سلالات خلايا الكلى الأخرى ، بما في ذلك خط من الخنزير (LLC-PK1) وآخر من القرد الأخضر الأفريقي (BS-C-1) تبقى أيضًا ملتصقة أثناء الانقسام وتكون أكثر عرضة للترنس. تحتوي كل من خلايا الخنازير والقرد على صبغيات أكثر من تلك الموجودة في كنغر الجرذ ، لكن سهولة نقل العدوى والتصوير تجعلها بدائل ممتازة للتحقيقات في الانقسام الفتيلي. بالإضافة إلى كونها مفيدة لملاحظات المغزل الانقسامي ، يمكن للخلايا التي تظل مسطحة على زجاج حجرة الثقافة أثناء انقسام الخلية أن تكشف أيضًا عن توزيع المكونات الخلوية الأخرى ، مثل جهاز جولجي ، وعناصر الهيكل الخلوي ، والشبكة الإندوبلازمية ، والميتوكوندريا.

الجدول 2 - خطوط خلايا الثدييات المفيدة لتجارب التصوير بالخلايا الحية

خط الخليةنوع الخلية (مورفولوجيا) المنشأ (الأنسجة)صنفعلامة (تطبيقات)
ب -16مغزلسرطان الجلدالفأرتنتج تحقيقات الهيكل الخلوي الميلانين
BHK-21الخلايا الليفيةكليةالهامسترتعداء البلازميد والفيروسات
CHO-K1طلائيةالمبيضالهامستريتطلب Proline DNA Transfection
COS-7الخلايا الليفيةكليةقردT Antigen DNA Transfection
LLC-PK1طلائيةكليةشخص شرهترنسفكأيشن الحمض النووي الانقسام
هيلاطلائيةعنق الرحمبشرسيتوكراتين ليسوفوسفاتيديل كولين
MDCKطلائيةكليةكلبقباب سيتوكراتين ، النقل
المعاهد الوطنية للصحة -3T3الخلايا الليفيةالجنينالفأرتعداء البلازميد
PC-12إجماليالغدة الكظريةجرذاستجابة عامل نمو العصب
PtK2طلائيةكليةالجرذ الكنغرتعداء Cytokeratin DNA

يجب إجراء تحقيقات الهيكل الخلوي مع الخلايا التي تظهر مستويات عالية من التعبير والتوطين المحدد للبروتين (البروتينات) التي تتم دراستها. عادةً ما يتم تحديد ألياف إجهاد الأكتين الشعيرية بشكل أكثر وضوحًا في الخلايا الليفية من الخلايا الظهارية ، ولكن هناك العديد من الاستثناءات. تشكل خيوط السيتوكيراتين الوسيطة شبكات واسعة في جميع أنحاء السيتوبلازم ، والتي يمكن تصورها بسهولة من خلال التألق المناعي أو البروتينات الفلورية في العديد من خطوط الخلايا الظهارية (على الرغم من أنها ليست عامة). لسوء الحظ ، فإن شبكات السيتوكراتين إما غير محددة بشكل جيد أو غائبة فعليًا في الخلايا الليفية ، بالإضافة إلى العديد من أنواع الخلايا الظهارية والبطانية. وبالمثل ، فيمنتين ، ديسمين ، محيطي ، خيوط عصبية ، لامين ، وبروتين ليفي دبقي حمضي (GFAP) تشكل الخيوط الوسيطة شبكات هيكلية بارزة في العديد من أنواع الخلايا ، ولكن يصعب اكتشافها في أنواع أخرى. في جميع الحالات تقريبًا ، يجب أولاً إصلاح خط الخلية المستهدفة واختباره باستخدام الفلوروفورات الاصطناعية و / أو وسم الجسم المضاد قبل محاولة توطين البروتينات الفلورية لتصوير الخلايا الحية.

فتحت مجموعة متنوعة من التطبيقات التي تقرن البروتينات الفلورية بتصوير الخلايا الحية العديد من السبل الجديدة في البحث عن المعلومات المتعلقة بالعمليات الديناميكية في بيولوجيا الخلية. تقنيات الفحص المجهري المتقدمة للشفاء بعد التبييض الضوئي (فراب) ، نقل طاقة الرنين (أقلق) ، التحليل الطيفي للارتباط (FCS) ، وفحص البقع المجهري (ولايات ميكرونيزيا الموحدة) استفادوا بشكل كبير في تطورهم من استخدام البروتينات الفلورية. تم أيضًا تعديل هذه الجزيئات الموجودة في كل مكان وراثيًا لإنتاج جيل جديد من أدوات التظليل الضوئية التي يمكن تنشيطها ضوئيًا لتمييز الأعضاء الفرديين لمجموعة جزيئية أكبر على وجه التحديد. الذهاب إلى أبعد من ذلك ، أدى اقتران تقنيات نقل طاقة الرنين فورستر إلى البروتينات الفلورية إلى إنتاج فئة جديدة من مجسات الاستشعار البيولوجي الفسيولوجية التي تفيد في الإبلاغ عن الأيونات المختلفة ، مثل الكالسيوم والصوديوم والبوتاسيوم والكلوريد ودرجة الحموضة ، بالإضافة إلى عدد كبير من الأحداث الخلوية بما في ذلك النشاط الأنزيمي ، والتغيرات في إمكانات الغشاء ، وإطلاق الناقل العصبي ، وتقليل الأكسدة. إن أساس كل هذه التقنيات الجديدة القوية مبني على تصوير الخلايا الحية التي تعبر عن تحقيقات الفلورسنت المشفرة وراثيًا.

معروض في الجدول 2 قائمة بالعديد من خطوط الخلايا الثديية التي كانت ذات خدمة كبيرة للعديد من تجارب التصوير بالخلايا الحية التي تم الإبلاغ عنها في الأدبيات العلمية. سرطان عنق الرحم البشري المدروس جيدًا (هيلا) هو خلية طلائية خالدة تم جمع ثروة من المعلومات منها. يمكن نقل هذا الخط الخلوي القلبية بكفاءة عالية مع معظم نواقل البروتين الفلوري لإنتاج مستويات عالية من التعبير والتوطين المحدد. تحويل خلايا الكلى القرد الأخضر الأفريقي (COS-7 line) لاستكشاف ديناميكيات البروتين في جهاز Golgi والشبكة الإندوبلازمية ، في حين أن خطوط خلايا الهامستر (BHK-21 و CHO-K1) هي المفضلة للتحقيقات التي تشمل البيولوجيا الجزيئية والخلوية للفيروسات ، والنشاط الأنزيمي داخل الخلايا ، والمستقبلات ، ووظيفة المروج ، وآليات النقل. تستجيب الخلايا الأخرى المدرجة في الجدول 2 أيضًا للترنسفكأيشن ، وتقنيات الحقن المجهري ، ووضع العلامات باستخدام الفلوروفورات الاصطناعية لتجارب التصوير طويلة المدى في الفحص المجهري واسع النطاق ومتحد البؤر.

نظرة عامة موجزة عن غرف التصوير بالخلايا الحية

غرف العينات هي فرع متكامل في تاريخ الفحص المجهري وقد تم نشر عدد من التصميمات على مر السنين لوصف الأنظمة التي تقدم خصائص بصرية ممتازة مع السماح بالاحتفاظ بالعينات لفترات متفاوتة من الوقت. يمكن إجراء تجارب التصوير قصيرة المدى (20 إلى 30 دقيقة أو أقل) ببساطة عن طريق إرفاق ساترة تحتوي على خلايا ملتصقة على شريحة مجهرية باستخدام الفواصل للحفاظ على الخلايا من التلف (يمكن أن يؤدي الإجهاد البدني إلى تألق ذاتي في بعض خطوط الخلايا). يمكن تأمين ساترة الغطاء بأي واحد من عدد من المواد المانعة للتسرب ، بما في ذلك الأغاروز المنصهر ، أو الأسمنت المطاطي ، أو الشحم الخوائي ، أو المستحضر المفيد المعروف باسم فالاب (خليط 1: 1: 1 من الفازلين واللانولين والبارافين) ، لتوفير ختم مانع لتسرب الماء والقضاء على تبخر وسط الاستزراع. يمكن استخدام الحشيات الرقيقة المقطوعة من مطاط السيليكون (متوفرة أيضًا تجارياً) أو القطع المكسورة من ساترة الفواصل لمنع الخلايا من الاتصال المباشر بشريحة المجهر. تأكد من وضع سطح ساترة يحتوي على الخلايا وجهًا لأسفل على الفاصل ، واملأ الفراغ بين الغطاء والشريحة بمخزن فسيولوجي (مثل محلول ملحي مخزّن من الفوسفات برنامج تلفزيوني). ختم الحواف حول ساترة باستخدام كاشف الاختيار ووضع شريحة المجهر على المسرح للتصوير. بدون وسط النمو والتحكم في درجة الحرارة ، ستعمل الخلايا بشكل طبيعي لبضع دقائق فقط ، ولكن غالبًا ما يكون هذا وقتًا كافيًا للحصول على الصور اللازمة.

بالنسبة للتجارب طويلة المدى ، توفر الغرف البيئية المصممة خصيصًا آلية لعرض وتصوير الخلايا الحية على مرحلة المجهر ، بالإضافة إلى الحفاظ على الثقافة قريبة جدًا من ظروف النمو المثلى لفترات طويلة من الزمن. بشكل عام ، تشتمل غرف التصوير على نافذة زجاجية ، عادة ما تكون بسمك ساترة (حوالي 170 ميكرومتر) ، يمكن من خلالها رؤية الخلايا بسهولة مع أهداف تعمل بفتحة عددية عالية. غالبًا ما يتم تحقيق التحكم في درجة الحرارة ، وهو معلمة مهمة لمعظم الخلايا ، باستخدام المصادر الطرفية للأشعة تحت الحمراء أو الهواء الساخن (مثل مجفف الشعر أو جهاز تسخين البيض) ، أو لوحة تسخين معدنية تحت تحكم الثرمستور مقترنة مباشرة بالغرفة ، أو شفافة بصريًا طبقات رقيقة من أكاسيد معدنية موصلة للكهرباء يتم تطبيقها بالتبخير على سطح الغطاء لتوفير نقل حرارة موصل أكثر كفاءة إلى الغرفة.

تندرج المجموعة الواسعة من الغرف المتاحة تجاريًا التي يمكن شراؤها (أو ، بدلاً من ذلك ، سهلة الإنشاء داخل المنزل) لتصوير الخلايا الحية عمومًا في فئتين وظيفيتين أساسيتين: افتح غرف ، على غرار أطباق بتري ، والتي تتمتع بحرية الوصول إلى الغلاف الجوي و مغلق غرف محكمة الغلق لحماية الخلايا من تبخر وسط الاستزراع. عادةً ما يسمح نظام الغرفة المفتوحة بالوصول السريع إلى الخلايا النامية ، وبالتالي يسمح بسهولة بالحقن المجهري ، أو إضافة الأدوية ، أو تغيير وسط المزرعة ، أو التلاعب الآخر بالخلايا. في المقابل ، توفر الغرف المغلقة عزلًا أفضل عن البيئة الخارجية ، ولكنها تجعل الوصول إلى الخلايا أكثر صعوبة. تشتمل معظم تصميمات الغرف المغلقة على منافذ تسمح بإضافة وسيط وعقاقير جديدة أثناء التجربة دون مقاطعة تسلسل التصوير. في هذه الأنظمة ، يتم تنظيم التروية إما عن طريق مضخة تمعجية ، أو حقنة مدفوعة بمحرك ، أو من خلال مشعب يتم التحكم فيه عن طريق الجاذبية. عند إضافة حلول جديدة إلى غرفة مغلقة ، فمن الأهمية بمكان أن تتم معايرتها قبل الإضافة إلى نفس درجة حرارة الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن العديد من الخلايا حساسة للقص ، لذا يجب إجراء نضح الخلايا الملتصقة المرتبطة بغطاء سفلي بمعدلات تدفق منخفضة للغاية. تم تصميم العديد من أنظمة الغرف المغلقة الأكثر تقدمًا لتوفير التحكم في قوى القص.

الشكل 2 - غرفة التصوير بالخلايا الحية وحاضنة مجهر البيئة المتحكم فيها

يتم إنشاء العديد من أبسط أنظمة التصوير التجارية ذات الغرفة المفتوحة عن طريق تركيب ساترة على الجزء السفلي من وعاء زراعة الأنسجة العادي أو طبق بتري. تتوفر أطباق بتري العقيمة القياسية مقاس 35 و 60 ملم والتي تحتوي على فتحة صغيرة (قطرها حوالي سنتيمتر واحد) محفورة في الطبق بغطاء 170 ميكرومتر مدمج في البلاستيك لتمكين التصوير عالي الدقة. تتوفر أيضًا شرائح مستطيلة الشكل وشرائح مجهرية مع غرفة تصوير بلاستيكية صغيرة مفردة أو متعددة ومختومة بالزجاج أيضًا ، ولكنها باهظة الثمن. كلا تصميمي الغرفتين سهل الاستخدام نسبيًا ، لكنهما غير مغلقين بإحكام ، لذا يجب مراقبة كمية وسط الاستزراع الذي يتبخر على مدار التجربة بعناية. بالإضافة إلى ذلك ، لا تشتمل معظم غرف التصوير البسيطة على أي نظام تدفئة ، ويجب تركيبها على مرحلة مجهر مزودة بوحدة تدفئة إضافية مصممة خصيصًا لإيواء الغرفة. بدون التحكم في درجة الحرارة ، يكون أداء نظام الغرفة المفتوحة البسيط أفضل بشكل هامشي فقط من استخدام طريقة الغطاء المختوم الموضحة أعلاه.

تعتبر الغرف المغلقة المغلقة المشابهة لغرفة التصوير بالخلايا الحية Bioptechs FCS2 الموضحة في الشكل 2 (أ) أكثر تكلفة من معظم أنظمة الغرف المفتوحة البسيطة ، ولكنها توفر بيئة أكثر تحكمًا ويمكنها الحفاظ على الخلايا في حالة صحية للكثيرين ساعات (وحتى أيام أو أسابيع). يوفر نظام الغرفة المغلقة النموذجي سطحين بصريين مفصولين بحلقة نضح مختومة بحشيات. يتم بعد ذلك تثبيت هذه الشطيرة مع غلاف معدني أو مركب مصمم لتوفير التحكم في درجة الحرارة والتكيف الآمن مع مرحلة المجهر. مع مثل هذه العلبة ، يتم التحكم في معدل التروية ، وحجم الوسائط ، ودرجة الحرارة ، والجو ، وهندسة التدفق ، والاستقرار البصري لغرفة التصوير بدرجة عالية نسبيًا مقارنة بغرف النظام المفتوحة. تقلل أنظمة الغرف المغلقة المتقدمة (الشكل 2 (أ)) من وقت تبادل السوائل ، وتوفر التحكم في التدفق لوسط التروية لتجنب إزعاج الخلايا الملتصقة ، وتوفر تنظيمًا فائقًا لدرجة الحرارة ، وتحافظ على قرب الأسطح البصرية للمراقبة باستخدام عدد عالٍ أهداف مجهر الفتحة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمستخدم تحديد ظروف تدفق الثقافة المتوسطة عبر سطح الخلية لتلبية المتطلبات التجريبية. تتوفر مجموعة متنوعة من أنظمة التصوير بالخلايا الحية ذات الغرفة المغلقة تجارياً.

تجمع قمة غرف تصوير الخلايا الحية بشكل فعال بين حاضنة زراعة الخلايا مع مجهر مقلوب لتوفير تحكم كامل تقريبًا في البيئة ، ويرد مثال على ذلك في الشكل 2 (ب). غالبًا ما يتم إنشاء حاوية الحاضنة من زجاج شبكي وتحيط بمرحلة المجهر والأهداف ومرشحات التألق ومكثف الضوء المنقول. يمكن استخدام هذه الغرف مع مجموعة متنوعة من أوعية الثقافة ، بما في ذلك زجاجات الثقافة القياسية ، وأطباق بتري ، وشرائح المجهر المزودة بغطاء مثبت ، والعديد من الأنظمة المفتوحة والمغلقة الأخرى التي تمت مناقشتها أعلاه. يتم الحفاظ على درجة الحرارة بوحدة تسخين خارجية (عادة ما يكون الهواء المدفوع) ويتم التحكم في تركيز ثاني أكسيد الكربون بوحدة استشعار مقترنة بمنظم يتم تغذيته بواسطة أسطوانة من الغاز النقي. يمكن أيضًا تجهيز هذه الوحدات بالتحكم في الرطوبة وتوفر العديد من التصميمات إمكانية الوصول إلى القفازات المطاطية لتجنب الإخلال بالتوازن البيئي عند التلاعب بالخلايا أثناء التصوير. من أجل الحفاظ على درجة عالية من التحكم في درجة الحرارة ، فإن العديد من غرف التفريخ الأكثر تعقيدًا تحتوي فعليًا على المجهر بالكامل باستثناء العدسات والكاميرا والمصابيح. على الجانب السلبي ، يمكن أن تعيق الغرف البيئية الوصول السريع إلى العينة وتكون مرهقة عندما يكون التلاعب المتكرر ضروريًا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يزيد مستوى الرطوبة المرتفع داخل الحجرة من تكلفة صيانة الجهاز بسبب التدهور المبكر لمواد تشحيم التروس وأكسدة الأسطح المعدنية وطلاء العدسات. يقدم معظم مصنعي المجاهر خيارًا مخصصًا للحاضنة لمجاهيرهم المقلوبة ، بينما يقوم موردو خدمات ما بعد البيع بملء الفجوات بنماذج أبسط وأكثر تقدمًا ، بالإضافة إلى مجموعة من الملحقات المفيدة.

كما نوقش أعلاه ، تتوفر مجموعة واسعة من تصميمات غرف التصوير بالخلايا الحية المفتوحة والمغلقة تجارياً ، وكثير منها مخصص لتطبيقات محددة تمامًا. من المفيد التحقق من الخيارات المختلفة المتاحة عند الشروع في الطريق الطويل لتصوير الخلايا الحية الناجح. فضل معظم الباحثين التقنيات التي تعكس خبرتهم في استخدام نظام معين ، وهذه التفضيلات تمتد إلى سلسلة تصاميم الغرف. في الواقع ، تم الإبلاغ عن العديد من الأنظمة الوظيفية التي تم إنشاؤها باستخدام صفائح عازلة لإصلاح المنازل وشريط لاصق وأجهزة ترطيب منخفضة التكلفة متصلة بالغرفة باستخدام أنابيب عادم مجفف الملابس. النقطة الأساسية هي أنه في تجربة معينة ، يجب أن تحافظ الغرفة على بيئة مثالية للوظيفة الخلوية وتوفر نافذة بصرية واضحة لالتقاط الأحداث التي تحدث داخل الغرفة. نظرًا لاختلاف المتغيرات التجريبية من تحقيق إلى آخر ، يمكن أن تتغير تفضيلات التصميم وأفضل نهج هو اختبار مجموعة متنوعة من الأنظمة من أجل تحديد النظام الأنسب لخط الخلية والظروف التجريبية.

التحكم في درجة الحرارة

مع جميع تكوينات تصوير الخلايا الحية ، يمكن أن تنشأ الصعوبات عند إجراء التجارب على الاستعدادات التي تتطلب درجات حرارة مختلفة بشكل كبير عن تلك الموجودة في بيئة المختبر المحيطة (لاحظ أن تقلبات درجات الحرارة في تصوير الخلايا الحية هي عادة القاعدة وليس الاستثناء). تعتبر الوظيفة الخلوية حساسة للغاية للتغيرات في درجات الحرارة ، مع تغيرات حتى في درجتين لها تأثيرات عميقة على فسيولوجيا الخلية. تتوفر مجموعة متنوعة من الطرق للتحكم في درجة حرارة الخلايا في مرحلة المجهر ، والعديد من الأنظمة التجارية الموصوفة أعلاه تتضمن عناصر تسخين مقترنة مباشرة بالغرفة. على الرغم من أن هذه الإستراتيجية توفر حلاً متكاملاً بسيطًا ، إلا أن التحكم في درجة الحرارة غالبًا ما يقتصر على الغرفة نفسها ويتجاهل المكونات المرتبطة التي قد تمارس تأثيرات سلبية على الحفاظ على درجة حرارة ثابتة. من بين أهم العوامل المرتبطة بتقلبات درجة الحرارة أن مرحلة المجهر ، والإطار ، والأهداف يمكن أن تكون بمثابة أحواض للحرارة وتتصدى لجهود نظام تسخين العينة. تتفاقم هذه المشكلة عند استخدام أهداف الغمر لأن وسيط الاقتران البصري ، والذي يمكن أن يكون الزيت أو الجلسرين أو الماء ، له موصلية حرارية أعلى بكثير من الهواء. إلى جانب القرب الشديد من أهداف الفتحة الرقمية العالية للعينة ، بالإضافة إلى الحمل الحراري للهدف نفسه ، يمكن حرمان النظام بأكمله من الحرارة بسرعة إذا لم يتم التحكم في الهدف حراريًا. في حالة الغرف الثابتة الموصوفة أعلاه ، غالبًا ما تكون المنطقة الواقعة تحت الهدف مباشرة تصل إلى 5 درجات (مئوية) أكثر برودة من بقية حجرة العينة.

الشكل 3 - تصاميم سخان موضوعية لتصوير الخلايا الحية

اعتمادًا على التكوين ، يمكن إحاطة المجهر بالكامل وتسخينه ، ولكن يمكن تجنب العديد من مشكلات التحكم في درجة الحرارة الحرجة ببساطة عن طريق استخدام السخانات الموضوعية المتاحة تجارياً (انظر الشكل 3) التي تستخدم الماء الساخن المتداول أو عناصر التسخين المقاومة. يمكن للسخانات الموضوعية ، عند دمجها مع نظام تسخين مناسب للعينة ، أن تعوض جزئيًا التدرج الحراري بين العينة وعناصر العدسة الأمامية. لاحظ ، مع ذلك ، أنه حتى مع وجود جهاز تسخين موضوعي ، لا يزال من الممكن أن يكون هناك تدرج في درجة الحرارة على طول البرميل الموضوعي أو بين الهدف والمجهر نفسه. إن غطاء التسخين القابل للتعديل والسخانات الموضوعية للسترة المائية المتداولة الموضحة في الشكلين 3 (أ) و 3 (ب) هي نفسها بشكل أساسي من وجهة نظر الديناميكا الحرارية. الاختلاف الوحيد هو أن الحرارة يتم إنتاجها كهربائيًا في البطانية (الشكل 3 (أ)) ، بينما يتم توليد الحرارة خارجيًا ونقلها بواسطة سائل إلى الهدف المغلف (الشكل 3 (ب)). في كلتا الحالتين ، يكون انتقال الحرارة غير فعال نسبيًا حيث يتم إشعاع الكثير من الحرارة بعيدًا عن الهدف إلى المنطقة الواقعة أسفل العينة مباشرةً بدلاً من نقلها إلى الهدف. والنتيجة المؤسفة هي أن الحرارة الخارجية المفرطة يتم توجيهها بشكل حراري إلى أعلى بالقرب من العينة لإنتاج اختلافات كبيرة في درجات الحرارة ودورة حرارية مفرطة في نظام التحكم في الغرفة.

تحتوي أهداف المجهر على ملفات تعريف حرارية تختلف كدالة لمعلماتها الفيزيائية. تم تصميم وبيع معظم الأهداف لغرض الفحص المجهري للخلية الثابتة (الذي يتم إجراؤه في درجة حرارة الغرفة) ، لذلك عند اختيار هدف لاستخدامه في تصوير الخلايا الحية ، يجب توخي الحذر للنظر فقط في تلك الأهداف التي تتمتع بالقدرة على تحقيق الكفاءة ساخنة. بصرف النظر عن قضايا التسخين الموضوعية ، يمكن أن يؤدي ركوب الدراجات في نظام التدفئة إلى تغيير موضع الغطاء والتسبب في انحراف العينة عن التركيز. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يدرك المحقق أن التسخين والتبريد المتكرر للهدف قد تم الإبلاغ عنه بشكل غير صحيح لتقليص العمر الافتراضي إلى حد كبير ، خاصة من حيث الطابع الخالي من الإجهاد لعناصر العدسة الداخلية. في الواقع ، هناك القليل من الأدلة الموثوقة على أن دورات درجة الحرارة تؤثر على خصائص الإجهاد في الأهداف المتخصصة ، ويمكن لمعظمها تحمل درجات حرارة تصل إلى 50 درجة مئوية دون ضرر. التأثير السلبي الوحيد لأهداف مجهر التسخين هو أن زيوت التشحيم برميل سدادة الانكماش يمكن أن تزيد في اللزوجة (تحقيق مرونة اللثة) خلال فترة زمنية أقصر من الأهداف التي لم يتم تسخينها. ومع ذلك ، في حالة أهداف الغمر الساخنة ، غالبًا ما يؤدي ميل زيت الغمر إلى التسلل إلى البرميل إلى إطالة عمر مواد التشحيم الأصلية.

للتركيبات الدائمة ، يمكن بناء صندوق كبير حول المجهر وتسخينه بالهواء الدافئ. في هذه الحالة ، يمكن موازنة معظم المجهر لدرجة حرارة واحدة لتوفير ميزة القضاء على أي حركة ناتجة عن التمدد الحراري لمكونات المجهر. ومع ذلك ، يجب أيضًا تقليل التيارات الهوائية المحيطة بغرفة العينة نفسها. عند إنشاء حاوية ، قد يكون الوصول إلى المجهر ومكوناته القابلة للتعديل محدودًا ، لذلك قد يكون من المفيد إنشاء الصندوق من مكونات شائعة نسبيًا وغير مكلفة في حالة الحاجة إلى تعديلات كبيرة.

الاعتبار الأخير هو التحكم الصارم في درجة الحرارة ليس فقط للميكروسكوب ، ولكن أيضًا للمختبر بأكمله. يتم تصنيع المجاهر الحديثة بمجموعة واسعة من المواد ، بما في ذلك الألومنيوم والبلاستيك والمواد المركبة والزجاج والنحاس والصلب ، وكلها لها معاملات تمدد حراري مختلفة. حتى تغيير درجة واحدة مئوية يمكن أن ينتج حركات غير مرغوب فيها في القطار البصري المجهر ، مما يؤدي إلى تحولات التركيز أو المحاذاة. غالبًا ما ينتج عن تكييف الهواء أو مجاري التدفئة القريبة من المجهر تقلبات موضعية في درجة الحرارة تؤدي في النهاية إلى مشاكل في التركيز. للمراقبة طويلة المدى ، يقوم العديد من الباحثين ببناء صندوق كبير يتم التحكم فيه حراريًا حول المرحلة (انظر المناقشة أعلاه) أو حتى وضع المجهر بأكمله في غرفة يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية (حالة عمل غير مريحة نسبيًا). تعتمد الاستراتيجية الدقيقة المستخدمة في النهاية على التطبيق المحدد ، ولكن من الأهمية بمكان مراعاة هذه المشكلات عند تصميم نظام تصوير بالخلايا الحية والمختبر الذي سيتم وضعه فيه.

الاعتبارات البيئية للمختبر

عند اختيار الغرفة التي سيتم استخدامها لتجارب التصوير بالخلايا الحية ، من الضروري التأكد من توفر التهوية الكافية لتبديد الأوزون المنبعث من الزئبق ومصابيح تفريغ الزينون ، وكذلك الأبخرة من المذيبات العضوية المستخدمة للتنظيف الأسطح الضوئية وتطهير مرحلة المجهر. اترك مساحة كافية حول نظام المجهر للتهوية المناسبة وكذلك تنظيف الأرضيات والمقاعد والطاولات والأجهزة التجريبية. غالبًا ما يمكن تتبع أعطال المعدات إلى مآخذ الهواء المسدودة أو الموجودة بالقرب من الأرض أو الموضوعة في مكان يصعب الوصول إليه. يجب الحفاظ على نظافة المختبر بدقة وصيانته بطريقة منظمة لتقليل مستويات الغبار والدخان والأبخرة الضارة الأخرى التي يمكن أن تقلل من الأداء البصري والإلكتروني. من أجل تقليل حدوث تلوث زراعة الخلايا الحية بالكائنات الدقيقة ، يجب مسح مرحلة المجهر والمنطقة المحيطة بها بشكل دوري باستخدام 70 في المائة من الإيثانول أو المناشف المطهرة التجارية. يجب تنظيف انسكاب وسائط الثقافة ، وهو عامل لا مفر منه في التلاعب بغرفة الخلايا الحية ، على الفور وتطهير المنطقة المحيطة تمامًا.

من بين مصادر الاهتزازات الميكانيكية التي يمكن أن تؤثر على أداء المجهر ، وحدات التدفئة والتبريد المركزية (أو معالجات الهواء) في العلية أو على سطح المبنى ، والثلاجات ، والحاضنات ذات درجة الحرارة المنخفضة (حتى في الغرف المجاورة) ، وحركة المرور عبر الممرات القريبة . الاهتزازات من الثلاجات والمصادر الأخرى التي قد لا تكون واضحة على الفور يمكن أن يكون لها تأثير شديد على استقرار المجهر. يمكن تطبيق مجموعة متنوعة من التقنيات لتقليل الغرفة وبناء اهتزازات منخفضة التردد ، بما في ذلك جداول العزل التي يتم التحكم فيها عن طريق التغذية المرتدة والممتلئة بالغاز (الخيار الأكثر تكلفة) ومنصات عزل اهتزاز البوليمر الاصطناعية المرنة منخفضة التكلفة نسبيًا (انظر الشكل 4) . يتم تسويق هذا الأخير في مجموعة متنوعة من الأشكال الهندسية ومستويات التخميد لتناسب مجموعة واسعة من التكوينات. غالبًا ما يؤدي الجمع بين وسادات الاهتزاز وصفيحة ثقيلة من الألومنيوم نصف بوصة أو منصة عزل مسبقة الحفر إلى تقليل الاهتزازات إلى مستوى غير ملحوظ. على الرغم من أن إطارات المجهر المقلوبة أثقل بكثير وعادة ما تكون أقل حساسية للاهتزاز مقارنة بالمجاهر المستقيمة ، إلا أنها لا تزال تستفيد من العزل. يمكن ، في كثير من الحالات ، تقليل الاهتزازات عالية التردد إلى حد كبير عن طريق تحميل سطح الطاولة بكتلة إضافية ، مثل طوب الرصاص. أخيرًا ، عندما تكون عمليات النزوح الصغيرة جدًا لميزات الدقة الفرعية موضوعًا للتحقيق ، فقد تكون هناك حاجة إلى خطوات إضافية ، مثل العمل في وقت متأخر جدًا من الليل أو في الصباح الباكر ، عندما تكون البيئة أكثر هدوءًا.

الشكل 4 - أنظمة عزل الاهتزازات

بالإضافة إلى الاهتزازات التي يتم إجراؤها عبر الأرضية ، يجب أيضًا مراعاة المصادر المحمولة جواً. تم الإبلاغ عن أن مراوح تبريد المعدات أو مراوح تكييف الهواء داخل المختبر ، وحتى ضوضاء العادم من المركبات القريبة (التي يتم إجراؤها من خلال نوافذ المختبر) ، تنتج اهتزازات مزعجة للفحص المجهري عالي الدقة على معدات مستقرة بخلاف ذلك. يمكن أن يؤثر اهتزاز مراوح التبريد الخاصة بأشعة الليزر والمعدات الرئيسية الأخرى أيضًا على محطات التصوير بالخلايا الحية. يمكن أن يكون جزء من أنبوب مجاري مرن يوضع بين مروحة التبريد ورأس الليزر فعالاً في فصل اهتزازات المروحة. في أنظمة الوسائط التي تتغذى بالجاذبية والتروية ، يمكن للاهتزازات الناتجة عن فقاعات الغاز من خلال محلول التغذية أن تقترن من خلال الأنبوب إلى حجرة العينة وتنتج عمليات إزاحة ميكانيكية دورية. يمكن أن تكون الضوضاء الصوتية أيضًا مصدرًا للاهتزاز وتقليل استقرار المجهر. يجب استبدال وحدات المروحة الصاخبة ونقل المعدات الأخرى التي تميل إلى إنتاج كميات كبيرة من الضوضاء (وربما الاهتزازات) ، إذا كان ذلك ممكنًا ، إلى غرفة أخرى. غالبًا ما تكون المجاهر مجهزة بمصادر ضوئية مدمجة ومحولات طاقة يمكنها تسخين إطار المجهر تدريجيًا وتنتج انجرافًا بؤريًا بطيئًا للعينة.

يعد التحكم في درجة حرارة الغرفة لنظام التصوير بالخلايا الحية بالمجهر المستقر مصدر قلق رئيسي آخر ويمكن أن يكون أحد أهم المشكلات التي تواجهها عند تسجيل تسلسل الفاصل الزمني. يمكن أن ينتج عن المجهر المحصور في غرفة صغيرة سيئة التهوية زيادة كبيرة في درجة الحرارة المحيطة. قد يتجاوز الحمل الحراري الناتج عن مصادر الضوء وأجهزة التحكم في درجة الحرارة والمصاريع والكاميرات وأجهزة الكمبيوتر وغيرها من المعدات السعة الاسمية للغرفة ، مما يتطلب خدمات نظام تبريد إضافي. يعمل التبريد الإضافي على تحسين تشغيل جميع المعدات الإلكترونية بشرط ألا يؤدي إلى حدوث اهتزازات وغبار إضافي. في هذا الصدد ، قد تصبح سعة مروحة التبريد لأجهزة كمبيوتر نظام المجهر ومحركات الأقراص عالية السرعة غير كافية لأن الهيكل مليء ببطاقات إنتاج الحرارة ، مثل تلك المستخدمة في وحدات التحكم في الكاميرا وبرامج معالجة الصور والذاكرة الإضافية. تتجلى المشاكل في تعطل النظام وزيادة الضوضاء وفي أسوأ الأحوال فقدان البيانات. غالبًا ما تؤدي إضافة مروحة صندوقية منخفضة الضوضاء إلى مبيت الكمبيوتر إلى تخفيف هذه الصعوبة.

على الرغم من أن المجاهر الحديثة المقلوبة (تلك الأكثر تفضيلاً لتجارب التصوير بالخلايا الحية) ، مثل سلسلة Nikon Ti2 ، تم تصميمها لتكون أدوات صلبة قائمة بذاتها من خلال قدر كبير من الجهد الهندسي لتقليل مصادر الاهتزازات ، إلا أن المكونات الإضافية لما بعد البيع يمكن أن تؤثر في كثير من الأحيان هذا الاستقرار المتأصل. تنتج الغالق السريعة ومبدلات المرشح البصري (عجلات المرشح) مستويات كبيرة من الاهتزاز أثناء التشغيل ، وعند توصيلها مباشرة بإطار المجهر ، غالبًا ما تسبب اضطرابات يمكن أن تستمر لعشرات إلى مئات من الألف من الثانية. بالإضافة إلى ذلك ، غالبًا ما تحتوي العديد من المجاهر على مستوى البحث على مكونات آلية مدمجة (قطع أنفية ، وأدوات تحكم في التركيز ، وما إلى ذلك) يمكن أن تكون مصادر للاهتزاز ما لم تحد الشركات المصنعة من سرعة هذه الأجهزة و / أو تحدث تأخيرات بين الوظائف الآلية والحصول على الصور . يمكن تقليل الاهتزاز من المكونات المساعدة بشكل كبير أو حتى التخلص منه عن طريق تركيب هذه الأجهزة بشكل مستقل على حوامل منفصلة مجاورة للميكروسكوب. تتوفر ألواح التجارب الضوئية المصنوعة من الألومنيوم الصلب والتي تحتوي على فتحات تثبيت مسبقة الحفر ، وهي مثالية لإيواء كل من مكونات المجهر والملحقات.

تركيز الانجراف

تعد التقلبات في الموضع المحوري للمستوى البؤري للميكروسكوب أثناء جمع الصور المتسلسلة من الخلايا الحية واحدة من أخطر المشكلات التي يتم مواجهتها بشكل متكرر في الفحص المجهري الزمني. كثيرا ما يطلق عليه تركيز الانجراف، عادةً ما تحدث التغييرات في المستوى البؤري للميكروسكوب بسبب تغيرات درجة الحرارة في غرفة التصوير أو داخل الغرفة التي يوجد بها الجهاز. يشير التحليل النوعي المعمم للعلاقة بين الحالة الحرارية للميكروسكوب وموضع المستوى البؤري إلى أن زيادة درجة الحرارة أو انخفاضها بدرجة واحدة (مئوية) يمكن أن تحول التركيز بمقدار نصف ميكرومتر تقريبًا (500 نانومتر).يمكن أن يساهم عدم انتظام السطح في أغطية الزجاج ، وكذلك عدم الاستقرار الميكانيكي الناشئ عن انزلاق التروس ، وضغط طبقات شحوم التزييت ، والاستقرار بين المكونات المتحركة للمجهر ، على الرغم من أنه ليس مصدرًا رئيسيًا للقلق ، في تركيز الانجراف. بدون جهاز التغذية الراجعة للمراقبة المستمرة وتصحيح التركيز ، فإن أحد أفضل العلاجات للانجراف هو استخدام حاوية يتم التحكم فيها حراريًا تغلف المجهر والمكونات المرتبطة به بالكامل. على الرغم من أنه من الممكن الحصول على تسلسلات صور تظل في بؤرة التركيز لفترات قصيرة من الوقت بدون معدات مساعدة ، إلا أن نسبة عالية من التجارب طويلة المدى تفشل بسبب انجراف التركيز. في جميع الحالات تقريبًا ، يمكن عادةً تتبع عدم الاستقرار الحراري الذي يؤدي إلى ثني الغطاء أو تدرجات درجة الحرارة في القطار البصري المجهر كمصدر للفشل.

يجب أن يكون التغلب على الانجراف البؤري أحد الاعتبارات الرئيسية أثناء تكوين المجهر لتصوير الفاصل الزمني ، خاصة عند استخدام أهداف الفتحة الرقمية العالية حيث يتطلب عمق التركيز الضيق (حوالي 300 نانومتر) موضعًا بؤريًا يتم الاحتفاظ به في حدود 100 نانومتر من الطائرة الأولية. يجب إحضار النظام بأكمله ، بما في ذلك المجهر ، والكاميرا ، والمصاريع ، وعجلات المرشح ، والإضاءة ، وتجميع غرفة الخلايا الحية ، والكمبيوتر المضيف إلى درجة حرارة التشغيل لمدة 24 إلى 48 ساعة على الأقل قبل بدء تسلسل التصوير بالفاصل الزمني. عند تجميع غرفة التصوير ، تأكد من أن الأغطية التي تحتوي على خلايا ملتصقة مثبتة بشكل آمن في أماكنها وأن الغرفة نفسها موضوعة على المسرح بطريقة لا تسمح بالحركة في الاتجاهات الجانبية أو المحورية. في دقة التصوير العالية ، يمكن أن تكون أهداف الغمر بالزيت مصدر انجراف التركيز حيث ينتشر الزيت عبر غطاء الحجرة وعنصر العدسة الأمامية (الأهداف الجافة لا تحتوي على هذه المشكلة). يجب استخدام سخان موضوعي ، تمت مناقشته أعلاه ، لجميع التكوينات التي تستخدم أهداف الغمر. بمجرد أن يكون المجهر في درجة حرارة التشغيل الصحيحة ويتم تجهيز جميع المعدات الأخرى للتجربة ، فإن مراقبة التركيز بتسلسل زمني أولي على مدى فترة من 12 إلى 24 ساعة باستخدام عينة ثابتة ومركبة بشكل دائم ستوفر مؤشرًا ممتازًا على استقرار النظام.

تم تقديم مجموعة متنوعة من حلول البرامج والأجهزة المتاحة تجاريًا من قبل مصنعي المجهر وما بعد البيع للتغلب على انحراف التركيز. العديد من الأجهزة عبارة عن أنظمة ضبط تلقائي للصورة تقيس المسافة بين العدسة الأمامية الموضوعية والعينة عن طريق استشعار الضوء أو الصوت المنعكس من السطح السفلي للغطاء (أقرب سطح للهدف) ، مثل نظام التركيز المثالي من نيكون 4 لـ Ti2 المجاهر المقلوبة. ومع ذلك ، يمكن إعاقة هذا النهج عند استخدام أهداف عالية الدقة للغطس بالزيت ، بسبب فقدان التباين والانعكاس أثناء مرور ضوء الاستشعار عبر الزيت. تستخدم أنظمة الضبط البؤري التلقائي الأكثر تقدمًا الليزر القريب من الأشعة تحت الحمراء منخفض الكثافة أو الصمام الثنائي الباعث للضوء (قاد) مصادر لعكس شعاع من الإضاءة من خلال الهدف وعلى السطح العلوي للغطاء (دعم الخلايا والاستحمام بواسطة وسط الثقافة) ، وبالتالي استعادة الضوء المنعكس مع الهدف وتمريره إلى جهاز الكشف الذي يتحكم في ردود الفعل الدائرة لضبط موضع الهدف فيما يتعلق بالواجهة المتوسطة ساترة الثقافة.

الشكل 5 - نظام التركيز التلقائي المجهر المقلوب

تتيح التغذية الراجعة الفورية لموضع العينة اكتشاف المسافة بين الغطاء والهدف في فترات ملي ثانية أثناء المراقبة ، وبالتالي يتم تصحيح انجراف التركيز تلقائيًا في الوقت الفعلي. هذه الأنظمة مفيدة بشكل خاص في إنهاء انجراف التركيز الناتج عن انخفاض درجة الحرارة الذي يحدث عند تغيير وسط المزرعة وإروته أو إضافة الكواشف (مثل الأدوية) إلى المزرعة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تسهيل فحص الخلايا لتحديد المرشحين للتصوير من خلال تصحيحات التركيز المستمر أثناء ترجمة المرحلة أثناء المراقبة وتحديد المواقع لجمع الصور متعددة النقاط. يسمح البرنامج المصاحب لأنظمة الضبط البؤري التلقائي بتحديد المستويات البؤرية بحرية من خلال ضبط عنصر تحكم الإزاحة. نظرًا للأطوال الموجية الطويلة التي يستخدمها الليزر أو مصدر ضوء LED ، فإن نظام الكشف عن الأشعة تحت الحمراء القريبة لا يتطفل على الأطوال الموجية المستخدمة للمراقبة ويجب أن يكون غير مرئي لكاشف التألق.

يتضح في الشكل 5 الرسم التخطيطي لآلية تصحيح انجراف التركيز التلقائي النموذجية لمجهر مقلوب (الشكل 5 (أ)) جنبًا إلى جنب مع نافذة طيفية تقارن ملامح انبعاث التألق لبروتينات الفلورسنت الشائعة مع الطول الموجي للخط الطيفي لليزر التركيز التلقائي ( الشكل 5 (ب)). يركز الليزر (أو الصمام الثنائي الباعث للضوء) على المستوى البؤري الخلفي للهدف ويتم تقديمه بالتوازي مع محور خط الوسط مع إزاحة محددة. حلقة التغذية الراجعة لتحديد المواقع تصحح للتحولات الهندسية الدقيقة بسبب انجراف التركيز في موضع الشعاع الذي ينعكس من الواجهة بين سطح الغطاء العلوي ووسط الثقافة. تمثل الملامح الانبعاثية الطيفية الموضحة في الشكل 5 (ب) العديد من البروتينات الفلورية الأكثر فائدة والتي تغطي منطقة الطول الموجي بين 450 و 700 نانومتر ، بما في ذلك السماوي المحسن (ECFP)، لون أخضر (EGFP) والأصفر (EYFP) البروتينات الفلورية ، وكذلك المتغيرات ذات الانزياح الأحمر المرجاني للشعاب المرجانية ، أحادية اللون البرتقالية كوسابيرا (mKO) و mCherry. لا يتداخل خط الليزر 870 نانومتر المستخدم بواسطة نظام تصحيح الانجراف البؤري مع إشارات البروتين الفلوري.

في الفحص المجهري المتحد البؤر بالليزر ، يتم غالبًا إجراء تصحيح انجراف التركيز أثناء تحقيقات الفاصل الزمني من خلال الحصول على صور محورية متعددة في كل نقطة زمنية مع التحليل اللاحق لكل مجموعة صور لتحديد مستوى بؤري مشترك يتوافق مع نقطة مرجعية محددة مسبقًا. تستخدم المناهج الأخرى خوارزميات برمجية تحدد الموقع البؤري بين النقاط الزمنية باستخدام وظائف التباين التي تسجل الصور في خطوات متتالية صعودًا وهبوطًا ومقارنة النتائج حتى يتم الحصول على أعلى مستوى من التباين (عند هذه النقطة يتم تعيين التركيز لتلك الفترة الزمنية). تعتمد تقنيات البرامج على مستوى ثابت نسبيًا من تباين العينات ، ومع ذلك ، غالبًا ما لا يكون هذا هو الحال مع التصوير بالخلايا الحية حيث يمكن للحطام والتحف الأخرى أن تطفو بشكل عشوائي في مجال الرؤية وتغير المستوى البؤري الأمثل الظاهري.

السمية الضوئية والتلف الضوئي

بصرف النظر عن السمية التي تحدث بسبب التركيزات المفرطة للفلوروفورات الاصطناعية والإفراط في التعبير عن البروتينات الفلورية ، فإن صحة وطول عمر الخلايا ذات العلامات المثلى في غرف التصوير بالمجهر يمكن أن تعاني أيضًا من عدد من العوامل الضارة الأخرى. أهمها الضرر الناجم عن الضوء (السمية الضوئية) التي تحدث عند التعرض المتكرر للخلايا ذات العلامات الفلورية للإضاءة من الليزر ومصابيح التفريغ القوسي عالية الكثافة. في حالة الإثارة ، تميل الجزيئات الفلورية إلى التفاعل مع الأكسجين الجزيئي لإنتاج جذور حرة يمكن أن تلحق الضرر بالمكونات الخلوية وتضر بالخلية بأكملها. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت العديد من التقارير إلى أن مكونات معينة من وسائط الاستنبات القياسية ، بما في ذلك فيتامين ريبوفلافين والحمض الأميني التربتوفان ، قد تساهم أيضًا في التأثيرات الضارة التي يسببها الضوء على الخلايا المستنبتة. البروتينات الفلورية ، نظرًا لحقيقة أن الفلوروفورات الخاصة بها مدفونة بعمق داخل غلاف واقي متعدد الببتيد ، فهي عمومًا غير سامة ضوئيًا للخلايا. ومع ذلك ، فإن العديد من الفلوروفورات الاصطناعية ، مثل MitoTracker والبقع النووية (Hoechst و SYTO cyanine dyes و DRAQ5) ، يمكن أن تكون شديدة السمية للخلايا عند إضاءتها لفترات زمنية قصيرة نسبيًا. في تصميم التجارب ، يجب اختيار الفلوروفورات التي تعرض أطول موجات إثارة ممكنة من أجل تقليل الأضرار التي تلحق بالخلايا عن طريق الإضاءة ذات الطول الموجي القصير.

يعرض الشكل 6 ثلاثة أمثلة على السمية الضوئية الناتجة عن إضاءة الخلايا الموصوفة بالفلوروفورات الاصطناعية أو التي تعبر عن بروتينات الانصهار الفلورية. خلايا الكلى الأرانب الطبيعية (RK-13) الموضح في الشكل 6 (أ) تم نقل العدوى لأول مرة باستخدام ناقل اندماج EGFP وتسلسل الاستهداف النووي للمستضد T لفيروس SV40 لتوطين التألق الأخضر داخل النواة. تمت معالجة الخلايا بعد ذلك لمدة 20 دقيقة باستخدام MitoTracker Red CMXRos وتم تصويرها بالتتابع في فواصل زمنية مدتها 30 ثانية لمدة 24 ساعة. بعد عدة ساعات ، بدأت فجوات تتشكل في المنطقة التي تحتوي على الميتوكوندريا المحيطة بالنواة. يتضح في الشكل 6 (ب) خلية ورم أرومي دبقي واحد (U-251 سطر) معربا عن بروتين مشيري الفلوري المدمج للإنسان بيتا- اكتين بعد عدة ساعات من الملاحظة. لاحظ التدهور الكبير في البنية الخلوية الذي حدث عندما يبدو أن الخلية تدخل النخر. انفصال خلايا جنين الفأر السويسري ألبينو (3T3 الخط) بعد ساعة من التصوير بعد العلاج باستخدام الصبغة النووية المرتبطة بالحمض النووي Hoechst 33342 الموضحة في الشكل 6 (ج). عادةً ما تُظهر الأصباغ النووية الممتصة للأشعة فوق البنفسجية (مثل Hoechst) تأثيرات سامة ضوئية أسرع من المجسات التي يتم تحفيزها عند أطوال موجية أطول في الطيف المرئي.

كما نوقش أعلاه ، تم الإبلاغ عن أن العازلة البيولوجية الاصطناعية HEPES تنتج تأثيرًا ضوئيًا على الخلايا في بعض الظروف (على الرغم من أنه في كثير من الحالات قد يُعزى ذلك بشكل مباشر إلى مستويات غير كافية من البيكربونات). يجب على المحقق أن يضع في اعتباره أن جميع الخلايا حساسة في جوهرها للضوء ، وأن إضافة الفلوروفور أو المكونات العطرية إلى وسط الاستزراع يضاعف فقط هذه الحساسية. يمكن فقط الحد من الضرر الناجم عن الجذور الحرة المتولدة من خلال فلوروفورز الحالة المثارة ، وليس منعه. ومع ذلك ، تمتلك الخلايا السليمة آليات إنزيمية متأصلة في تحويل الجذور الحرة إلى مركبات أقل ضررًا ويمكن أن تتحمل إثارة التألق بشرط أن تكون أنظمة الإنزيم الخاصة بها غير مشبعة. يمكن أن يؤدي تقليل مستوى الأكسجين في الوسط ، بشرط أن تتمكن الخلايا من تحمل سحب الأكسجين ، إلى تحقيق غرض مزدوج يتمثل في الحد من درجة التبييض الضوئي وإنتاج الجذور الحرة.

الشكل 6 - التأثيرات الخلوية السامة للنباتات من الفلوروفورات التركيبية والوراثية

بغض النظر عن قدرة الخلايا على التعامل الإنزيمي مع السمية الناتجة عن الفلوروفور ومكونات وسط المزرعة ، يجب تقليل تعرض الخلايا للضوء في إعداد التصوير إلى أدنى مستوى ممكن من أجل الحد من المصادر الأخرى لتلف الخلايا وتقليل إمكانات القطع الأثرية في التجربة. يمكن تقييد جرعة الإضاءة لكل صورة عن طريق التطبيق الحكيم لمرشحات الكثافة المحايدة (لمصابيح تفريغ القوس) ، وخفض طاقة خرج مصدر الإضاءة (لليزر) ، وتجميعات مصراع البرمجة لتقييد التعرض لضوء الإثارة الفلوري فقط أثناء التقاط الصور. بالإضافة إلى ذلك ، يجب اختيار عرض النطاق الترددي لمرشح التألق بعناية لتقليل عدد وشدة الأطوال الموجية غير الضرورية التي ستضيء الخلايا بضوء غير مفيد للتصوير. يتم المساعدة في القدرة على تقليل مستويات الإضاءة بنجاح في التصوير بالخلايا الحية من خلال استخدام أهداف ذات فتحة عددية عالية تتميز بأفضل إنتاجية للضوء وأقل عدد من العناصر البصرية.

حتى في حالة عدم وجود الفلوروفورز ، فإن حساسية خلايا الثدييات للتعرض للأشعة فوق البنفسجية موثقة جيدًا (وهي ظاهرة تُعرف باسم ضوئي) ، والعديد من خطوط الخلايا حساسة على الأقل للضوء الأزرق في مناطق الطول الموجي المستخدمة لإثارة بروتينات الفلورسنت السماوي والأخضر. لتقليل التلف الضوئي والسمية الضوئية عند إعداد تجربة التصوير ، يجب إجراء تصور للخلايا الحية أثناء تكوين المجهر عند أدنى مستويات الضوء التي يمكن من خلالها ملاحظة الخلايا ، ويجب إجراء ذلك في أسرع وقت ممكن. يجب استخدام مرشحات الكثافة المحايدة (أو طاقة الليزر المنخفضة جدًا) لتخفيف مصدر الإضاءة ومن الأفضل تحقيق تصور الخلايا باستخدام نظام التصوير الرقمي. تستغرق مراقبة الخلايا من خلال العدسات المجهرية عدة ثوانٍ ، وهي أطول بعشرة أضعاف مما هو مطلوب غالبًا للحصول على صورة ذات جودة كافية لاختيار الخلية والتركيز. بدلاً من ذلك ، يمكن تحديد موقع الخلايا المرشحة للتصوير باستخدام تباين المجال الساطع أو تباين الطور أو تباين التداخل التفاضلي (مدينة دبي للإنترنت) أوضاع التصوير. في جميع الحالات ، يجب استخدام مرشح تداخل أخضر أو ​​أحمر أثناء الإعداد لتحسين التباين وتقليل تعرض الخلايا للضوء الأزرق.

نشأ التطبيق الواسع لمرشحات 546 نانومتر (خضراء) لدراسات تصوير الخلايا الحية لأن منطقة الطول الموجي هذه تتطابق مع أحد الخطوط الطيفية الرئيسية المنبعثة من مصابيح تفريغ القوس الزئبقي. ومع ذلك ، نادرًا ما يكون تحقيق مستويات كافية من شدة الإضاءة مشكلة في تحقيقات الخلايا الحية ويتم تصحيح الأهداف الحديثة لدرجة أنها لا تتطلب استخدام الضوء الأخضر للتصوير عالي الدقة. وبالتالي ، يجب أن يقتصر اختيار أطوال موجات الإضاءة على تلك الموجودة في المناطق التي تتحملها الخلايا بشكل أفضل. مباشرة قبل الانقسام الخلوي (الطور) ، تكون معظم خطوط الخلايا الثديية حساسة جدًا للأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء ، وتكون أقل حساسية للضوء الأحمر والأخضر والأزرق بترتيب تنازلي. وبالتالي ، من أجل تقليل التلف الضوئي إلى الحد الأدنى ، فإن مرشحات التداخل باللون الأحمر مع منطقة ممر نطاق يتراوح بين 600 و 650 نانومتر هي الخيار المثالي لرصد الخلايا الحية. يتم أيضًا تقليل التألق الذاتي في خلايا وأنسجة الثدييات في الأطوال الموجية الأطول لطيف الضوء المرئي. لاحظ أن الدقة الضوئية تعتمد على الطول الموجي وأن الضوء الأحمر ينتج أقل القيم النظرية للدقة بسبب الأطوال الموجية الأطول المعنية. ومع ذلك ، في معظم الحالات ، لا يكون استخدام الضوء الأحمر هو العامل المحدد لأن درجة الدقة التي يتم تحقيقها في تصوير الخلايا الحية غالبًا ما تتأثر بالحركة الخلوية الداخلية وانحرافات درجة الحرارة والعيوب في النظام البصري وتقلبات الإضاءة.

عند اختيار المرشحات لتجارب التصوير بالخلايا الحية ، يجب اختيار عرض النطاق الترددي بعناية حتى يتم التخلص من مستويات تتبع الأشعة تحت الحمراء والأشعة فوق البنفسجية. على الرغم من أن تصميمات مرشحات ممر النطاق الحديثة تؤدي أداءً جيدًا في المناطق الوسطى من طيف الضوء المرئي ، إلا أنها غالبًا ما تمرر الإشعاع بأطوال موجية منخفضة جدًا وعالية جدًا. لذلك يُنصح بتركيب مرشحات زجاجية متخصصة بالقرب من مصدر (مصادر) الإضاءة لمنع أطوال موجات الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء الضارة. ينتج الزئبق ، وبدرجة أقل ، مصابيح الزينون مستويات عالية من الضوء فوق البنفسجي ، بينما تنبعث مصابيح الهالوجين التنغستن (المنقولة) كميات كبيرة من ضوء الأشعة تحت الحمراء. كخطوة أخيرة ، يجب تركيب مصاريع إلكترونية (لكل من مصابيح الهالوجين التنجستن ومصابيح التفريغ القوسي) للحد من تعرض الخلايا للإشعاع الضار خلال الفترات التي لا يتم فيها التقاط الصور. يعد الإغلاق الحكيم لمصدر الإضاءة أحد أهم العوامل في تجارب التصوير بالخلايا الحية الناجحة.

جعلت التطورات في تكنولوجيا الكاشف على مدى السنوات القليلة الماضية من الممكن زيادة خفض مستويات الإضاءة في تجارب التصوير بالخلايا الحية. كاثودات أنبوب مضاعف ضوئي حساسة بشكل متزايد للفحص المجهري متحد البؤر والجهاز المتقدم المقترن بالشحن (اتفاقية مكافحة التصحر) يتم تقديم أنظمة الكاميرا للفحص المجهري واسع المجال باستمرار. إن أنظمة الكاميرا المكثفة ومضاعفة الإلكترون المتاحة الآن قادرة على تصوير الخلايا الحية بحساسية عالية عند مستويات الضوء المنخفضة للغاية. تستخدم العديد من هذه الكاميرات أجهزة CCD ضعيفة الظهر ، والتي عادةً ما يتم تبريدها وتتميز بكفاءة كمية عالية عبر المناطق الطيفية المرئية والقريبة من الأشعة تحت الحمراء لزيادة الحساسية. في حالة عدم توفر أفضل الكاميرات ، يمكن زيادة الحساسية من خلال دمج الإشارة من عدة وحدات بكسل (وهي عملية تُعرف باسم بينينغ) على حساب الدقة المكانية. في الفحص المجهري متحد البؤر ، سيؤدي الحفاظ على نسب تكبير منخفضة إلى تقليل مستوى السمية الضوئية للخلايا. تؤدي زيادة عامل التكبير / التصغير البؤري إلى مسح الكمية الإجمالية لضوء الليزر عبر منطقة أصغر من العينة ، وبالتالي تعريض الخلايا لإضاءة أكثر كثافة.

دائمًا ما يكون اختيار المستوى الدقيق لتوهين الضوء ووقت التعرض الصحيح تمرينًا تجريبيًا. بالنسبة لخط خلوي جديد ذي معلمات غير معروفة ، فإن أفضل استراتيجية هي تخفيف الضوء قدر الإمكان وتطبيق أوقات تعريض قصيرة جدًا بحيث تكون الهياكل الخلوية بالكاد مرئية في الصورة التي تم الحصول عليها. أفضل مكان للبدء هو مرشح الكثافة المحايدة بكثافة بصرية 1.0 ووقت تعرض يبلغ 100 مللي ثانية أو أقل. بالنسبة للمجاهر (كنفوكل) المسح بالليزر ، ابدأ بقوة ليزر تبلغ حوالي 1 بالمائة وقم بزيادة الجهد (واكتساب ، إذا لزم الأمر) للمضاعف الضوئي. استخدم البكسل أوقاتًا أقصر بحوالي 50 بالمائة من تلك التي تنتج عادةً مستويات إشارة مناسبة. إذا كانت الخلايا قادرة على تحمل هذا المستوى من الضوء من خلال تجربة الفاصل الزمني طويلة المدى ، فيمكن زيادة شدة الإضاءة ووقت التعرض ببطء في التجارب اللاحقة حتى يتم التوصل إلى حل وسط عملي بين الإشارة إلى الضوضاء وصلاحية الخلية. وتجدر الإشارة إلى أنه غالبًا ما توجد علاقة غير خطية بين المقدار الإجمالي للتعرض للضوء الذي يمكن أن تتحمله الخلية وطول أوقات التعرض الفردية. بشكل عام ، تبدو الخلايا أكثر صحة عندما تتعرض لنبضات ضوئية قصيرة جدًا ، نظرًا لأن التعرض الطويل (أكثر من نصف ثانية) غالبًا ما يكون مميتًا لفترات طويلة من الزمن.

مراقبة جدوى الخلية وتقلبها

بعد أن يتم تحميل غرفة التصوير بالخلايا الحية بخلايا جديدة وتجميعها وتركيبها على مرحلة المجهر ، فإن الخطوة التالية هي تصور الخلايا لتحديد حالتها العامة وتشكلها ، وتحديد المرشحين المناسبين للتصوير. في الغالبية العظمى من التجارب ، خاصةً عند تصوير الخلايا التي تم نقلها مؤخرًا بشكل عابر ببروتينات الفلورسنت ، سيكون هناك قدر كبير من التباين المورفولوجي في مجتمع الخلايا. ليس من غير المألوف ملاحظة الخلايا التي لم يتم نقلها أو تظهر ضعف توطين المسبار. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نسبة مئوية من الخلايا المصابة بالعدوى المنقولة سوف تفرط في التعبير عن البروتين الفلوري ، غالبًا إلى درجة خلق تأثير سام محتمل. قد تُظهر الخلايا الأخرى مشاكل صحية شائعة (كما هو موضح في الشكل 7) تتجلى في شكل انفصال عن الركيزة ، وتشكيل فجوة مفرط ، وتضخم الميتوكوندريا ، والفقاعات السيتوبلازمية.يمكن أن يُظهر نفس خط الخلية في الثقافات المختلفة أنماطًا متباينة من الديكور والخرز الذي قد يكون أحد أعراض عوامل الإجهاد المختلفة. غالبًا ما يؤثر تدهور الصحة على معدل نمو الخلايا وحركتها ، مما يؤدي عادةً إلى انخفاض عام في النشاط. ومع ذلك ، لا يُشار دائمًا إلى ضعف الصحة من خلال انخفاض النشاط الخلوي حيث يمكن أن تظهر الخلايا المعرضة زيادة ملحوظة في حركات العضيات الشبيهة بالبراون. لا ينبغي متابعة الخلايا التي تظهر انحرافًا طفيفًا عن المظهر الطبيعي والصحي من أجل التصوير وجمع البيانات. علاوة على ذلك ، إذا تم الحكم على أكثر من 50 في المائة من السكان على أنهم غير صحيين ، فيجب التخلص من الثقافة بأكملها واستبدالها بأخرى في حالة فسيولوجية أفضل.

الشكل 7 - الأعراض البصرية للتباين المورفولوجي في الخلايا غير الصحية

يتم إجراء العديد من تجارب التصوير بالخلايا الحية باستخدام خلية واحدة فقط أو بضع خلايا على الأكثر. يجب على المحقق أن يضع في اعتباره أن مورفولوجيا الخلايا في المزرعة يمكن أن تتنوع تمامًا فيما يتعلق بالأنماط الظاهرية الظاهرة الموجودة. يمكن أن يكون عدم التجانس هذا نتيجة للخلايا في مراحل مختلفة من دورة النمو أو ربما اختلافات جوهرية بين أفراد المجتمع (الأخير أكثر وضوحًا في الثقافات الأولية). لهذا السبب ، غالبًا ما يكون من الضروري تسجيل البيانات من عدد من الخلايا الفردية من أجل الحصول على عينات ذات دلالة إحصائية للسلوك والديناميكيات الخلوية. كما نوقش أعلاه ، يجب على المحقق أن يضع في اعتباره أن ظروف التصوير في ملاحظات الخلايا الحية يجب أن تكون مقلقة إلى الحد الأدنى للخلايا حتى لا تؤثر بشكل كبير على النتيجة التجريبية. من بين أهم جوانب تجارب التصوير بالخلايا الحية ، وضع معيار للحكم على صحة الخلايا قيد الدراسة بحيث يمكن تقييم نجاح التجربة بشكل موضوعي. ستختلف المعايير الدقيقة اعتمادًا على التجربة ، ولكن أحد أهم العوامل التي يجب مراعاتها هو ما إذا كانت النتيجة المتوقعة قد تحققت دون تلف الخلايا التي لحقت بعملية التصوير. في بعض الحالات ، يمكن مطابقة الظاهرة قيد الدراسة مع النتائج التي تم الحصول عليها بخلايا ثابتة ، ولكن هذا غالبًا ما يكون غير ممكن.

يجب مراقبة تجارب التصوير للتأكد من أن الظروف التجريبية (وسط الثقافة ، استراتيجية التخزين المؤقت ، الغلاف الجوي ، تكوين الغرفة) لا تغير بشكل كبير معدل النمو أو مؤشر الانقسام أو خصائص موت الخلايا المبرمج للخلايا. إذا أمكن ، يجب تقييم الآثار السلبية المحتملة لكل مكون تجريبي بشكل منفصل. على سبيل المثال ، يجب أن تنمو الخلايا في وسط الثقافة المستخدم لتجربة التصوير في حاضنة قياسية لثاني أكسيد الكربون ويتم الحكم عليها من حيث الجدوى ، ومؤشر الانقسام ، والتغيرات المورفولوجية العامة. كاختبار نهائي ، يمكن بعد ذلك تثبيت الخلايا في غرفة التصوير البيئي (بدون إضاءة) لعدد من الساعات ثم تقييمها بالمثل. تعزل هذه الاستراتيجية المساهمات المختلفة لصحة الخلية العامة وتحدد بسهولة أي إجراءات تتطلب التعديل.

كما تمت مناقشته أعلاه ، تتعرض الخلايا لجرعات عالية من الإضاءة أثناء تجارب التصوير بالخلايا الحية ، ومن المحتمل أن تكون تلك التي تحمل علامات الفلوروفور موضع تقدير لتوليد الأنواع الجزيئية التفاعلية التي يمكن أن تؤثر بشكل خطير على الوظيفة الخلوية. لذلك من الآمن (ومن الحكمة) افتراض حدوث مستوى معين من الضرر على الأقل أثناء تجربة التصوير ويجب اتخاذ خطوات لتحديد ما إذا كانت كبيرة بما يكفي لإحداث تأثيرات ضارة. يتم تحقيق ذلك بشكل أفضل من خلال ترك الخلايا في غرفة التصوير في مرحلة المجهر بعد الانتهاء من التجربة مع الفحص الدوري اللاحق لتحديد ما إذا كانت الخلايا تبدأ في موت الخلايا المبرمج أو تدخل وتكمل الانقسام. أثناء عملية التقييم بعد التجربة ، يمكن تسجيل الصور ذات الفواصل الزمنية على فترات زمنية متباعدة على نطاق واسع (من 10 إلى 30 دقيقة) على مدى عدد من الساعات.

تعتمد معايير تحديد صلاحية الخلية على المسارات المناسبة الموجودة في الخلايا قيد الفحص. تحتوي بعض خطوط الخلايا الثديية المحولة على نقاط تفتيش لدورة الخلية البائدة والتي تجعل قرارات التقدم الانقسامي والاستماتي عديمة الفائدة. يجب تقييم كل نوع خلية بعناية لتحديد المعايير التي يمكن استخدامها لتقييم الجدوى بعد تسلسل التصوير باستخدام المجهر. من بين أبسط المقايسات التي تلي تجربة التصوير مقارنة الحالة الصحية والتشكل الظاهري للخلايا التي تعرضت للضوء أثناء التحقيق مع الخلايا المجاورة في نفس الغرفة التي لم تتعرض للإضاءة. تعتبر السمات المماثلة في المجموعتين ، عند ملاحظتها مع تباين الطور أو مدينة دبي للإنترنت ، مؤشرًا جيدًا على عدم المساس بالصحة العامة. يجب اتباع هذه الملاحظة بالتصوير الفلوري للتأكد مما إذا كان توطين الفلوروفور قد تغير أثناء التجربة. أخيرًا ، يجب ملاحظة مجموعتي الخلايا بشكل متقطع لعدة ساعات (أو أيام) بعد التجربة لمعرفة ما إذا كانت الخلايا المعرضة للتصوير تتصرف بشكل مشابه للخلايا غير المصوّرة. غالبًا ما تكشف المقارنات من هذا النوع عما إذا كان قد حدث ضرر كبير للخلايا قيد الدراسة.

يعد فحص المسار الانقسامي أثناء التصوير بالخلية الحية آلية ممتازة يمكن من خلالها مراقبة الخلايا بحثًا عن التلف الضوئي. غالبًا ما تفشل الخلايا التي بدأت للتو في دورة الانقسام الفتيلي عن طريق بدء تكثيف الكروموسوم (الطور الأولي) في الدخول إلى الطور الأولي ومن ثم إكمال انقسام الخلية عند تلفها بسبب الإضاءة المفرطة. يمكن أن يكشف مسح الثقافة باستخدام المجهر الذي يعمل في وضع تباين التداخل التفاضلي عن تلك الخلايا التي تبدأ الانقسام الفتيلي ، ويمكن عزل مرشح مناسب للفحص الدقيق في ظل ظروف التصوير التجريبية الفعلية. إذا خضعت الكروموسومات لتفكيك التكثيف خلال فترة المراقبة وفشلت الخلية في الدخول مرة أخرى في الانقسام الفتيلي في غضون عدة ساعات ، فهناك احتمال كبير بحدوث تلف ضوئي. لاحظ أن تغيير وسط المزرعة سيبدأ أيضًا في إزالة تكاثف كروموسومات الطور الأولي في العديد من الخلايا ، لذلك يجب إجراء هذا التحليل بعد عدة ساعات من وضع الخلايا في مرحلة المجهر. تختلف خطوط الخلايا بشكل كبير في قدرتها على تحمل الضوء أثناء الانقسام. يمكن أن تكون الخطوط الثابتة والثقافات الأولية للخلايا البشرية والحيوانية حساسة للغاية للضوء ، في حين أن الخلايا المشتقة من الأجنة (مثل ذباب الفاكهة والديدان الخيطية) غالبًا ما تفتقر إلى مسارات لإيقاف دورة الانقسام استجابة لتلف الحمض النووي وتكون أكثر تحملاً للتلف الضوئي.

الشكل 8 - التلوث الجرثومي في مزارع خلايا الثدييات

بصرف النظر عن المشاكل العديدة المرتبطة بالتلف الضوئي والسمية الضوئية ، فضلاً عن متطلبات الصيانة الصارمة المفروضة على تصوير الخلايا الحية ، يجب أن يكون المحقق أيضًا في حالة تأهب لإمكانية حدوث تلوث جرثومي أثناء التجربة. أكثر أنواع العدوى شيوعًا هي تلك التي تحدث بسبب البكتيريا والفطريات والميكوبلازما والخمائر والعفن وفي حالات نادرة البروتوزوا. ما لم يصبح حدثًا متكررًا ، فإن طبيعة العدوى أو الأنواع المعنية ليست بنفس أهمية تحديد مصدر التلوث. بشكل عام ، تعتبر الكائنات الحية الدقيقة سريعة النمو أقل إشكالية نظرًا لحقيقة أنها عادة ما يتم اكتشافها بسهولة ويمكن التخلص من الثقافة بسرعة. الأهم من ذلك هو تلك العدوى التي يكون وجودها خفيًا ، ولا يمكن تصورها أثناء الفحص الروتيني للثقافة بسبب الحجم المادي ، أو تمكين الغازي من النمو بمستوى لا يمكن اكتشافه. يعد الإفراط في استخدام المضادات الحيوية في وسط المزرعة مشكلة شائعة تؤدي غالبًا إلى تلوث منخفض المستوى ، والذي يمكن أن يظل غير مكتشف لفترات طويلة من الوقت وقد يتداخل في النهاية مع الوظيفة الخلوية الطبيعية للثدييات.

معروض في الشكل 8 صور مجهرية توضح ثلاثة من أكثر المصادر المرئية شيوعًا للتلوث الميكروبي في مزارع الخلايا الحية. يتم اكتشاف النمو البكتيري غير المراقب (الشكل 8 (أ)) بسهولة عند التكبير العالي (غالبًا ما يكون مصحوبًا بانخفاض سريع في متوسط ​​درجة الحموضة المستنبتة) ويمكن حتى تصويره على أنه تعكر في وسط الاستزراع بالعين المجردة عندما تبدأ أعداد الكائن الحي في الوصول التشبع. الخميرة (الشكل 8 (ب)) تنمو بشكل أبطأ بكثير من البكتيريا ، ولكن لها فكرة استعمارية مميزة تكشف عن وجودها. عادة ما يتفوق تلوث العفن (الشكل 8 (ج)) على مزرعة في غضون 24 إلى 48 ساعة ، ويمكن غالبًا تحديده على أنه تسلل كثيف ليفي. ربما يكون أخطر أشكال التلوث غير واضح باستخدام تقنيات المجهر الروتينية المعززة للتباين (تباين الطور و DIC). يمكن للميكوبلازما (غير موضحة) أن تغير بشكل خطير سلوك الخلية والتمثيل الغذائي ، ولكن لا يمكن التعرف عليها بسهولة في مزارع الخلايا إلا من خلال العلامات الدقيقة للتدهور التدريجي في كثير من الأحيان. يجب إجراء فحوصات المايكوبلازما بشكل روتيني لضمان خلو الثقافات من هذه الأداة الخطيرة في تصوير الخلايا الحية. مجموعة متنوعة من طرق الكشف مفيدة للكشف عن وجود الميكوبلازما ، بما في ذلك التلوين الفلوري (باستخدام الصبغة النووية Hoechst) ، تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والتصوير الإشعاعي الذاتي.

التصوير الزمني

تم تقديم التصوير الديناميكي للنشاط البيولوجي في عام 1909 من قبل طالب الدكتوراه الفرنسي جان كوماندون ، الذي قدم أقدم الأفلام السينمائية التي تم الإبلاغ عنها بفاصل زمني عن داء اللولبيات المنتجة لمرض الزهري ، قبل 5 سنوات من إخراج تشارلي شابلن لفيلمه الأول. تقنية كوماندون التي سماها ميكروسينماتوغرافيا، تمكن من إنتاج أفلام تلتقط الأحداث في العالم المجهري والتي يمكن تسجيلها باستخدام كاميرا سينما ضخمة مثبتة على مجهر هش في المجال المظلم. أثبتت هذه الأفلام أنها مفيدة في تعليم الأطباء كيفية التمييز بين الحلزونات اللولبية المسببة للأمراض وتلك غير المؤذية ، وأظهرت كيف يمكن استخدام ملاحظات الفاصل الزمني للحصول على معلومات بيولوجية مهمة دون اللجوء إلى تحليل الصور أو المعالجة أو حتى القياسات الكمية التجريبية. على مدار الـ 75 عامًا التالية ، قام العديد من علماء الميكروسكوب بتكييف كاميرات أفلام السينما المتقدمة بشكل متزايد مع المجهر من أجل إنتاج أفلام أفضل تدريجيًا بدقة أعلى بكثير.

نظرًا لأن كاميرات الفيديو القائمة على الأنبوب أصبحت ميسورة التكلفة في أواخر السبعينيات وأوائل الثمانينيات من القرن الماضي ، بدأ الباحثون في ربط هذه الأجهزة بالمجاهر الضوئية لإنتاج تسلسلات صور متقطعة ومقاطع فيديو في الوقت الفعلي. في نهاية المطاف ، أفسحت الكاميرا الأنبوبية الطريق لمصفوفة المنطقة CCD في أوائل التسعينيات ، مما يبشر بعصر جديد في التصوير المجهري ويشير إلى الزوال النهائي للفيلم. مع أنظمة الكاميرات الرقمية المتقدمة المتوفرة في القرن الحادي والعشرين ، أصبحت التقنية الشائعة بشكل متزايد للتصوير السينمائي بفاصل زمني مطبقة على نطاق واسع لالتقاط الأحداث التي تحدث في الخلايا الحية على مدى فترات تتراوح من بضع ثوانٍ إلى عدة أسابيع (أو حتى أشهر). تتضمن هذه التقنية التصوير المتكرر لثقافة الخلية في نقاط زمنية محددة ، وبالتالي توفير معلومات حول العمليات الديناميكية التي لا تعد ولا تحصى والتي تحدث غالبًا مع توزيع واسع للمقاييس الزمنية. عندما تقترن تحقيقات الفاصل الزمني بوضع العلامات على الخلايا ذات الفلوروفورات الاصطناعية والبروتينات الفلورية المشفرة وراثيًا ، يمكن التحقيق في الأحداث على المستويات دون الخلوية والجزيئية.

يمكن إجراء التصوير الفاصل الزمني في بعدين مكانيين باستخدام تقنيات ويديفيلد وتمتد إلى أبعد من التصوير ثلاثي الأبعاد باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. بالإضافة إلى ذلك ، تم تجهيز المجاهر البؤرية الحديثة ببرنامج مسح الخطوط للتصوير السريع والمتكرر لخطوط المسح الفردية. يتضمن التصوير بالفاصل الزمني ثنائي الأبعاد الالتقاط المتسلسل للطائرات البؤرية الفردية (x-ذ في مجهر ويديفيلد و x-ذ, x-ض، و ذ-ض في الفحص المجهري متحد البؤر) ، بينما ينتج التصوير ثلاثي الأبعاد مكدسات بصرية من مستويات بؤرية متعددة في مجموعة متنوعة من التنسيقات الأبعاد مع عينات سميكة. عندما تكون نقطة محورية واحدة في المستوى الجانبي (x و ذ) مع ض-التصوير المكدس كدالة للوقت ، يشار إلى التقنية أ 4-د التصوير الزمني. وبالمثل ، فإن إضافة البعد الخامس (الطول الموجي) ينتج عنه 5-د التصوير أثناء إضافة أطوال موجية متعددة أو مناطق جانبية متعددة إلى 4-د المكدس يشار إليه باسم 6-د التصوير الزمني. كما هو موضح أعلاه ، يمكن أن تتراوح الفترات الزمنية لتجميع الصور المتسلسل باستخدام هذه التقنيات من ميلي ثانية إلى أيام أو حتى أشهر.

عدد متزايد من الجزيئات الصغيرة ، مجسات الفلورسنت الاصطناعية الحيوية التي تنتج أنماط وسم خلوية أو شبه خلوية محددة للغاية متاحة الآن تجارياً. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الجهد الهائل لإنتاج بروتينات فلورية مفيدة لها ألوان انبعاثية تمتد على طيف الأشعة تحت الحمراء المرئي والقريب بدأ ينتج عنه نتائج مشجعة. يتم الآن بشكل روتيني دمج البروتين الفلوري الأخضر والمتغيرات الطيفية ذات الصلة مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية للكشف عن التفاصيل المتعلقة بجغرافيا البروتين والحركة والنسب والكيمياء الحيوية في الخلايا الحية. في هذا الصدد ، قدمت هذه التحقيقات البيولوجية نهجًا جديدًا مهمًا لفهم وظيفة البروتين ، وهي الخطوة المنطقية التالية للتحقيقات في العمليات الخلوية الآن بعد أن تم تحديد تسلسل الجينوم للعديد من الكائنات الحية. إن السطوع المتأصل والثبات الضوئي للعديد من البروتينات الفلورية يجعلها مناسبة تمامًا للتصوير المتكرر المطلوب في دراسات الفاصل الزمني. توفر المجسات الفلورية الاصطناعية والمشفرة وراثيًا معًا مجموعة لا حصر لها من الاحتمالات لتصوير المكونات الجزيئية في الخلايا الحية.

الشكل 9 - Time-Lapse DIC وتصوير الخلايا الحية الفلورية

يتضح في الشكل 9 عدة صور من تسلسل زمني بفاصل زمني مدته 24 ساعة للأرنب الظهاري الكلوي (RK-13) الخلايا التي تم التقاطها باستخدام مزيج من التألق والتداخل التفاضلي. تم نقل الخلايا باستخدام وهم من بروتين مشيري الفلوري المدمج في الإنسان بيتا-الاكتين للكشف عن توزيع هذا المكون الهيكلي الخلوي في جسم الخلية الرئيسية وكذلك lamellapodia. يشير السهم الأبيض في الشكل 9 (أ) إلى بدء الكشكشة السيتوبلازمية بالقرب من مجموعة كبيرة من الأكتين في المنطقة الوسطى من الخلية. مع تقدم التسلسل ، يبدأ الكشكشة الصغيرة في الانتفاخ والانبثاق باتجاه الجانب الأيسر من الصورة ، في حركة تشبه الموجة ، مع تركيز بروتين اندماج الأكتين ذي العلامات الزاهية في الحافة الأمامية أثناء نموها (يشار إليها بالأسهم الموجودة في الشكل 9 (ب) حتى 9 (د)). عندما ينتشر lamellapodium لتغطية مساحة كبيرة ، تتشكل مجموعات صغيرة من الأكتين المسمى خلف الحافة الأمامية (الأسهم في الشكلين 9 (هـ) و 9 (و)) في العناصر الهيكلية التي قد تكون بودوسومات تشارك في عملية الالتصاق الخلوي مع الركيزة الزجاج.

يتم دعم تقنيات التصوير الفاصل الزمني بشكل كبير من خلال تطبيق المكونات الإضافية المجهرية الهامة ، مثل مصاريع الضوء الإلكترونية ، وعجلات المرشح ، والمراحل الآلية ، وآليات تصحيح الانجراف البؤري ، والتي يمكن تنسيقها والتحكم فيها بواسطة كمبيوتر مضيف باستخدام الحصول على الصور المتاحة تجاريًا البرمجيات. تعتبر المصاريع الإلكترونية ضرورية لمنع إضاءة العينة بين حالات التعرض للكاميرا عند تصوير الخلايا ذات العلامات الفلورية من أجل تقليل التلف الضوئي والسمية الضوئية والتبييض الضوئي ، وبالتالي زيادة جودة الصور بشكل كبير وصلاحية الخلية على مدى فترات طويلة من الوقت تستخدم غالبًا في الوقت- تجارب الفاصل. يتطلب التصوير المتزامن للعديد من الفلوروفورات ، بالإضافة إلى التصوير الفلوري المشترك والتصوير DIC ، عجلات ترشيح آلية يمكنها التبديل بسرعة بين عدة مرشحات مضان و / أو مستقطب. من الناحية العملية ، يتم التحكم في إضاءة الإثارة بواسطة عجلة ترشيح تحتوي على اثنين أو أكثر من مرشحات إثارة النطاق الترددي ، بينما يتم جمع انبعاث التألق من خلال عجلة ترشيح ثانية تضم إما ممر نطاق أو مرشحات حاجز طويل (انبعاث). تحت الهدف ، يتم تثبيت مرآة ثنائية اللون متعددة الممرات لتنسيق الحجب والانعكاس لأطوال موجات الإثارة والمرور المتزامن لأطوال موجات الانبعاث من خلال عنصر بصري ثابت واحد. يمكن لعجلات المرشح المتقدمة التبديل بين المرشحات المجاورة في غضون 30 إلى 50 مللي ثانية باستخدام مصاريع إلكترونية لها مواصفات تشغيل في نفس النطاق ، وهو العامل المحدد في تحديد أقصر فترة زمنية ممكنة بين الصور المتتالية في تسلسل الفاصل الزمني.

في الفحص المجهري متحد البؤر ، يقتصر جمع الصور بفاصل زمني على سرعة مرايا المسح. يتم تحقيق أعلى معدلات المسح عن طريق تقليل أبعاد بكسل الصورة واستخدام أسرع سرعة نقطية متوفرة على الجهاز ، ولكن هذا يقتصر عادةً على ما يقرب من 8 إلى 10 إطارات في الثانية. يتطلب جمع تسلسلات الصور على فترات زمنية أقصر مسحًا أحادي الخط أو أدوات المجال الكاسح أو مجاهر القرص الدوار. يمكن لقرص الدوران الحديث ومجاهر المجال المسحوق التقاط تسلسلات الصور بشكل روتيني بمعدلات عالية ، تتراوح من واحد إلى عدة مئات من الإطارات في الثانية ، وعادة ما تكون محدودة فقط بسرعة نظام الكاميرا الرقمية أو المضاعف الضوئي. تم تصميم هذه الأدوات لاستيعاب مجموعة من المتغيرات التجريبية في التصوير بفواصل زمنية عالية السرعة عند مستويات إضاءة منخفضة للغاية.

الاستنتاجات

يمكن أن تكون تجارب تصوير الخلايا الحية قوية بشكل غير عادي ، ولكنها يمكن أن تستفيد بشكل كبير من التحقيقات التكميلية باستخدام فحوصات الخلايا الثابتة للمساعدة في التحقق من صحة الظواهر التي يتم ملاحظتها في الخلايا الحية. على الرغم من أن هذا قد يبدو غير بديهي نظرًا لحقيقة أن فحوصات الخلايا الحية غالبًا ما يتم الاحتفاظ بها كمعيار للديناميات الخلوية والجزيئية ، يمكن التغلب على الصعوبات التقنية وخطر إتلاف الخلايا أثناء التحقيقات بشكل كبير إذا كانت النتائج مماثلة من حيث الحركية والنقطة الزمنية يمكن التحقق من الأحداث بالخلايا الثابتة. في كثير من الحالات ، لا يمكن ببساطة مقارنة الخلايا الثابتة بتصوير الخلايا الحية ، إما لأن حركية الحدث سريعة جدًا أو لأن طبيعة التجربة (على سبيل المثال ، الديناميكيات) لا يمكن إجراؤها بشكل مفيد داخل الخلية الثابتة. علاوة على ذلك ، فإن الهدف من تجربة الخلية الحية هو الكشف عن الأحداث أو الخصائص التي لا يتم ملاحظتها أو تفسيرها بسهولة في الخلايا الثابتة. ومع ذلك ، من الجدير النظر في استخدام هذا النهج كأسلوب لرصد الأحداث التي شوهدت في تجارب أطول الفاصل الزمني لتأكيد عدم وجود آثار ضارة من خلال الإضاءة الممتدة.

تمكّن الأجهزة الحديثة من تصوير العينات الحية بنسب إشارة إلى ضوضاء عالية باستخدام مستويات منخفضة للغاية في إضاءة الحوادث وتقف الآن كأسلوب قوي لتحليل الديناميات الجزيئية داخل الخلايا.تعزز التطورات المستمرة في تقنيات التصوير وتصميم المسبار الفلوري قوة هذا النهج وتضمن مستقبله كأداة مهمة في علم الأحياء الحديث. من المحتمل أيضًا أن تؤدي التطورات التكنولوجية والمفاهيمية في الأجهزة إلى دفع الدقة المكانية والزمانية إلى حدود جديدة ، فضلاً عن إتقان أساليب الفحص المجهري الفلوري المستخدم حاليًا. يبدو أن العديد من الأساليب التي تم تقديمها مؤخرًا ، مثل استنفاد الانبعاث المحفز والفحص المجهري 4Pi ، هي تقنيات واعدة لتصوير الخلايا الحية ، ولكن لم يتم بعد تحديد إمكانية استخدامها على نطاق واسع في التطبيقات البيولوجية ، وهناك قيود على سمك عينات مقبولة. في التحليل النهائي ، ومع ذلك ، فإن الرعاية الفنية والخبرة اللازمتين لإجراء تجربة تصوير ناجحة للخلايا الحية مع الأجهزة المتاحة حاليًا كبيرة ، وحتى مع التقدم المحتمل ، لا تزال هناك العديد من العقبات.

المؤلفون المساهمون

مايكل إي دايلي - قسم العلوم البيولوجية وبرنامج علم الأعصاب ، مبنى 369 علم الأحياء ، جامعة أيوا ، أيوا سيتي ، أيوا ، 52242.

دانيال سي فوشت - Bioptechs Inc.، 3560 Beck Road، Butler، Pennsylvania، 16002.

أليكسي خوجاكوف و كونلي ل.ريدر - مركز وادزورث ، وزارة الصحة بولاية نيويورك ، ألباني ، نيويورك ، 12201 ، ومختبر الأحياء البحرية ، وودز هول ، ماساتشوستس ، 02543.

كينيث ر. سبرينغ - مستشار علمي ، لوسبي ، ماريلاند ، 20657.

ناثان س, سكوت جي أولينيتش, جون د.جريفين، و مايكل دبليو ديفيدسون - مختبر المجال المغناطيسي الوطني العالي ، 1800 East Paul Dirac Dr. ، جامعة ولاية فلوريدا ، تالاهاسي ، فلوريدا ، 32310.

منتجات نيكون ذات الصلة

سلسلة Eclipse Ti2

يوفر مجهر Eclipse Ti2 المقلوب مجال رؤية لا مثيل له يبلغ 25 مم (FOV) يُحدث ثورة في طريقة رؤيتك.

متحد البؤر سلسلة CSU القرص الغزل

تتيح سلسلة CSU من أنظمة الأقراص الدوارة متحد البؤر للمسح الميداني من Yokogawa Life Sciences ، والمتكاملة مع أنظمة المجاهر الرائعة من Nikon والبصريات ، للمستخدمين أنظمة مرنة وقوية لمجموعة واسعة من تطبيقات التصوير.


نقاش

وصفنا دخول اللقاح IMV إلى خلايا هيلا وأظهرنا أن عملية الإصابة بالفيروس لها العديد من الميزات المثيرة للاهتمام. أولاً ، يتطلب اللقاح IMV بلمرة أكتين قبل دخول الخلية. هذا الفيروس & # x0201csurfing & # x0201d يتطلب ديناميات أكتين طبيعية تم الإبلاغ عنها لبعض الفيروسات القهقرية وفيروس التهاب الفم الحويصلي (36). قد يتحول التزحلق إلى آلية نقل مشتركة بين العديد من الفيروسات إذا تمت إضافة فيروس اللقاح إلى قائمة أولئك الذين يستخدمونه. كما شاركت نتوءات الأكتين التي تنظمها ديناميكيات الأكتين في غشاء البلازما في تجنيد اللقاح IMV. بعد ذلك ، أظهرنا أن جزيئات IMV قد تم تحصينها في خلايا هيلا بطريقة مستقلة عن مسارات clathrin- و caveola ولكنها تعتمد على الدينامين ، مما يشير إلى مسار دخول الفيروس من خلال الالتقام الطور السائل (7). تم توضيح دور الدينامين 2 الداخلي في دخول اللقاح IMV إلى خلايا هيلا باستخدام ثلاثة أساليب تجريبية ، أولاً باستخدام شكل إسوي معبر لـ DN-Dyn1 ، ثم مع مثبط خاص بالدينامين ، وهو dynasore ، وأخيراً باستخدام نهج siRNA. في أيدينا ، قام DN-Dyn2 بحظر امتصاص الترانسفيرين ولكن ليس دخول IMV ونعتقد أن مستوى أعلى من DN-Dyn2 ضروري لمنع دخول الفيروس أكثر من منع امتصاص الترابط. بدلاً من ذلك ، قد يحتوي الدينامين الداخلي المنشأ في خلايا هيلا على متغيرات التضفير التي تفاعلت مع DN-Dyn1 و DN-Dyn2 مع صلات مختلفة. تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من الوظيفة الواضحة للدينامين في تكوين الحويصلة المطلية بوساطة الكلاذرين والكافولا ، إلا أن دوره في عمليات الالتقام المستقل عن الغلاف مثل امتصاص السوائل كان مثيرًا للجدل (1 ، 17 ، 18 ، 23 ، 24 ، 35). تم الإبلاغ عن أربعة متغيرات ربط للدينامين 2 (8 ، 54) ، وطفرات DN GTPase لجميع متغيرات التضفير الأربعة منعت امتصاص الترانسفيرين جيدًا ، ومع ذلك ، قام اثنان فقط من متغيرات الربط بمنع امتصاص ديكستران ، مما يشير إلى وظائف تفاضلية لمتغيرات الربط المميزة في امتصاص السوائل (7). علاوة على ذلك ، حددنا وتميزنا VPEF ، وهو بروتين خلوي جديد مهم لاختراق اللقاح IMV في خلايا هيلا. اقترحت بياناتنا أيضًا أن VPEF والدينامين يتوسطان في اختراق IMV من خلال آليات مختلفة. لا يزال يتعين توضيح كيفية تفاعل VPEF مع المكونات الفيروسية للسماح بالاختراق في المستقبل. تم اكتشاف VPEF mRNA في العديد من خطوط الخلايا الثديية (البيانات غير معروضة) ، مما يشير إلى وظيفة محفوظة لـ VPEF. لن يكون هذا مفاجئًا للغاية ، نظرًا للعدوى الواسعة للمضيف لفيروس اللقاح بينما أظهرنا أهمية VPEF في خلايا هيلا ، يبقى أن نحدد ما إذا كان نفس الاستنتاج سينطبق على أنواع الخلايا الأخرى. كما أنه ينتظر المزيد من التجارب لتحديد ما إذا كان الشكل خارج الخلية لفيروس اللقاح يتطلب VPEF لدخول الخلية أم لا.

نظرًا لأن ارتباط فيروس اللقاح بالخلايا عند 4 & # x000b0C كان غير فعال نسبيًا وكان فقط 1 إلى 2 & # x00025 من الجسيمات الفيروسية المدخلة مرتبطة بالخلايا بعد فترة حضانة لمدة 60 دقيقة (37) ، كان علينا استخدام MOI عالية نسبيًا (MOI & # x0003d 40 إلى 100) التهابات في EM والتحليلات (كنفوكل). باستخدام مقايسات التعبير الجيني الفيروسي المبكر ، لاحظنا أن دخول اللقاح IMV في خلايا هيلا ظل حساسًا لـ BFLA في العدوى منخفضة وزارة الداخلية (MOI & # x0003d 0.1 إلى 5) ، مما يدعم فكرة أن وزارة الداخلية في حد ذاتها لم تملي مسارات دخول الخلية المستخدمة عن طريق الفيروسات. وتجدر الإشارة أيضًا إلى أن الالتقام الخلوي لسلالة WR من اللقاح IMV في خلايا هيلا ، كما هو موصوف هنا ، ليس مجرد قطعة أثرية للعدوى عالية وزارة الداخلية لأن عدوى الخلايا بسلالة IHD-J من اللقاح IMV في وزارة الداخلية عالية من 200 إلى 300 لم ينتج عنها الالتقام الخلوي الواضح في خلايا BSC-1 (58) وخلايا هيلا (37).

باختصار ، تُظهر هذه النتائج أن اللقاح IMV قادر على قرصنة الأكتين الخلوي للاقتراب من أجسام الخلايا وإدارة دخول الخلايا عن طريق اختطاف مسار نقل السوائل المعتمد على VPEF في كل مكان والذي يعد جزءًا من الذخيرة الطبيعية لهذه الخلايا. نفترض أن VPEF يمثل شحنة أو مكونًا جديدًا من الحجرة المستقبلة الأولى لنظام تهريب الحويصلات المستقل عن الكلاذرين والكافولين (41) لامتصاص سوائل المرحلة السائبة. سيتطلب التحقق من هذه الفرضية مزيدًا من الدراسة.


نتائج ومناقشة

يختلف تفاعل MT بشكل كبير بين P3 من RABV الممرضة وغير المسببة للأمراض

لتقييم علاقة ارتباط P3-MT بالإمراضية ، عبرنا عن P3 من سلالات Ni و Ni-CE RABV المدمجة في البروتين الفلوري الأخضر (GFP الشكل 1) في لوحة من خطوط الخلايا الثديية من الأنسجة العصبية والخارجية للعديد من RABV الأنواع الحساسة / المضيفة 23 ، 24 ، 25 ، 26 ، بما في ذلك COS-7 (كلية القرد الأخضر الأفريقي) ، NSC-34 (تشبه الخلايا العصبية الحركية للفأر) ، SK-N-SH (الخلايا العصبية البشرية) ، هيلا (الظهارية البشرية) و NA (ورم أرومي عصبي للفأر). تم تأكيد التعبير عن البروتينات بواسطة محللات التحليل الغربي لخلايا COS-7 (انظر الشكل التكميلي S1).

P3 هو شكل إسوي مبتور طرفيًا من بروتين P يشتمل على بقايا 53 & # x02013297 ، والذي يتم إنشاؤه في الخلايا المصابة عن طريق المسح الريبوزومي المتسرب الذي ينتج عنه ترجمة من كودون AUG داخلي يتوافق مع M53 (السهم) من بروتين P كامل الطول (يسمى P1) 10. يشار إلى أن CTD (التي تحتوي على مناطق ربط MT و N-RNA و STAT1) و NTR (التي تحتوي على مجال dimerization) يشار إلى مواضع البقايا أسفل بروتين P1. تختلف المخلفات في المواضع 56 و 58 و 66 و 81 و 226 بين P3 من السلالات الممرضة (Ni) والسلالات الموهنة (Ni-CE) لـ RABV (البدائل في Ni-CE-P3 باللون الأحمر).

لقد وجدنا سابقًا أن تفاعل MT بواسطة P3 المنصهر بـ GFP من سلالة RABV CVSII يمكن اكتشافه في الخلايا الحية بواسطة CLSM باعتباره ارتباطًا بشبكة خيطية حشوية 19. تمشيا مع هذا ، لوحظ تفاعل واسع النطاق لـ GFP-Ni-P3 مع خيوط السيتوبلازم في جميع أنواع الخلايا التي تم اختبارها (COS-7 ، NSC-34 ، كما هو موضح في الشكل 2 أ ، و SK-N-SH ، هيلا ، NA ، غير معروض ). الأهم من ذلك ، أن ارتباط خيوط GFP-Ni-CE-P3 كان ضعيفًا بشكل واضح في كل نوع من أنواع الخلايا هذه ولوحظت اختلافات مماثلة بين Ni-P3 و Ni-CE-P3 غير المنصهرة في خلايا COS-7 الثابتة المناعية (انظر الشكل التكميلي. S2). تم التأكد من أن الخيوط المرتبطة بـ Ni-P3 هي MTs استنادًا إلى الحساسية للأدوية التي تستهدف MT (الشكل 2 ب) ، والتناغم مع mCherry-tubulin في الخلايا الحية (الشكل 2 ج) والتوبيولين الداخلي في الخلايا الملطخة بالمناعة (الشكل 2 د) ). وبالتالي ، يختلف ارتباط MT بين بروتينات P3 من الفيروسات المسببة للأمراض والمضعفة.

(أ) تم نقل خلايا COS-7 للتعبير عن البروتينات المشار إليها قبل التحليل بواسطة CLSM للخلية الحية ، كل صورة تمثل الخلايا في 30 مجال رؤية تم أخذ عينات منها على 3 فحوصات منفصلة (COS-7) أو 9 مجالات رؤية (NSC-34) . (ب & # x02013d) تم علاج خلايا COS-7 المنقولة للتعبير عن GFP-Ni-P3 مع أو بدون تاكسول أو نوكودازول (ب) شارك في نقل العدوى للتعبير عن mCherry-tubulin (ج) أو ثابت ومضخم مناع لـ & # x003b2-tubulin (د) قبل التحليل بواسطة CLSM colocalization في b و d يظهر كتلوين أصفر في الصورة المدمجة. (ه) تم تحليل خلايا COS-7 الحية التي تعبر عن البروتينات المشار إليها بواسطة CLSM لإنشاء صور ثلاثية الأبعاد مفككة (تُظهر الصور صورًا ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها معروضة أسفل المحور z). (F) صور مثل تلك التي تظهر في (ه) لاشتقاق متوسط ​​قيم طول الشعيرة (mFL & # x02009 & # x000b1 & # x02009SEM n & # x02009 & # x02265 & # x0200930 من 3 فحوصات متطابقة). تم تحديد قيم p باستخدام اختبار Mann Whitney.

الجيد ص يحتوي الجين على طفرات مقارنة بالنيكل ص ينتج عنها 5 بدائل لبقايا الأحماض الأمينية ، واحد أو أكثر منها يفسر الوظيفة المختلفة في عداء الإنترفيرون وإمراضية 13 ، 20 ، 21. تؤثر جميع البدائل على تسلسل P3 (الشكل 1) ، مما أدى إلى أربعة بدائل برولين متجمعة داخل المنطقة الطرفية N (NTR) ، واستبدال الهيستيدين (N).226-H) في مجال الطرفية الكروية C (CTD). أشارت دراسات رسم الخرائط السابقة إلى أن المجال الأخير يتوسط في الارتباط بـ MTs 19. لفحص تأثيرات طفرات معينة ، عبرنا عن GFP-Ni-P3 المحتوي على N226-H وحده (GFP-Ni-P3-N226-H) أو طفرات NTR (GFP-Ni-P3-CENTR) للتحليل على النحو الوارد أعلاه. رابطة خيوط MT لـ GFP-Ni-P3-N226-H ، ولكن ليس GFP-Ni-P3-CENTR، كان ضعيفًا بشكل واضح في خلايا COS-7 و NSC-34 (الشكل 2 أ) و SK-N-SH و HeLa و NA (غير موضح).

لتحديد مدى ارتباط شبكة MT ، والتأثيرات عليها ، لطفرات Ni-CE ، أنشأنا صورًا ثلاثية الأبعاد مفككة للخلايا الحية التي تعبر عن بروتينات P3 المنصهرة GFP (تظهر الصور المعروضة أسفل المحور z في الشكل 2 هـ) ، وتم تطويرها منهجية لاكتشاف وقياس GFP الخيطية داخل الخلايا باستخدام إماريس أداة خوارزمية تتبع الشعيرات البرمجية (انظر المواد والطرق) وهذا على حد علمنا هو أول تطبيق لهذه الأداة لتحديد تفاعل البروتين- MT في الخلايا الحية. أتاح هذا الاكتشاف شبه الآلي للخيوط المرتبطة بـ P3 في خلايا مفردة لحساب إجمالي طول الشعيرة. المناظرة يعني طول الشعيرة تم تحديد (mFL) لكل خلية لـ & # x02265 30 خلية لكل بروتين تم اختباره (الشكل 2f). أكدت النتائج أن جمعية MT لـ GFP-Ni-CE-P3 و GFP-Ni-P3-N226-H ، ولكن ليس GFP-Ni-P3-CENTR، تم تخفيضه بشكل ملحوظ مقارنة بـ GFP-Ni-P3 (p & # x02009 & # x0003c & # x020090.0001 و p & # x02009 = & # x020090.0118 لـ Ni-CE و Ni-P3-N226-H ، على التوالي) ، مع N.226-H الطفرة وحدها تسبب ج. انخفاض بنسبة 50٪ في mFL من Ni-P3. وهكذا ، ن226-H ، ولكن ليس طفرات NTR ، تؤثر بشكل مباشر على ارتباط P3-MT. ومع ذلك ، منذ N.226- H وحدها لا تلخص بشكل كامل النمط الظاهري لـ Ni-CE-P3 (الشكل 2f) يبدو أن طفرات NTR يمكن أن تزيد من تأثير N226-H ، مما يدل على الدور غير المباشر / التنظيمي لجهاز NTR.

للتأكد من أن تقليل mFL لـ Ni-CE-P3 و Ni-P3-N226- H بسبب انخفاض التفاعل مع MTs ، أجرينا الاستخراج السيتوبلازمي للخلايا المنقولة لإزالة البروتين غير المرتبط بـ MT ، كما هو موصوف 27 ، قبل التحلل المناعي لتحليل MTs و CLSM. أشارت كمية تحديد مكانة P3-MT باستخدام معامل Pearson & # x02019s إلى أن ارتباط MT متضرر بشكل كبير (p & # x02009 & # x0003c & # x020090.0001) لـ GFP-Ni-CE-P3 و GFP-Ni-P3-N226-H مقارنة بـ GFP-Ni-P3 (الشكل 3). ومع ذلك ، فإن قدرة Ni-P3-N226بقي -H لربطه بـ MTs أكبر من تلك الموجودة في Ni-CE-P3 ، بما يتوافق مع البيانات من فحوصات تتبع خيوط الخلية الحية (الشكل 2f).

ن226- طفرة H تمنع تلامس P3 مع MTs (أ) تم استخلاص خلايا COS-7 التي تعبر عن البروتينات المشار إليها لإزالة البروتين القابل للذوبان (غير المرتبط بـ MT) قبل التثبيت والتثبيت المناعي لـ & # x003b2-tubulin ، والتحليل بواسطة CLSM (يظهر التلون باللون الأبيض في الصورة المدمجة). (ب) صور مثل تلك التي تظهر في (أ) لاشتقاق معامل Pearson & # x02019s كمقياس للتلوين بين GFP-P3 و & # x003b2-tubulin (يعني & # x000b1 SEM n & # x02265 14 خلية من فحصين). تم تحديد قيم p باستخدام اختبار Student & # x02019s أو اختبار Mann-Whitney.

يتم إضعاف تجميع MT بواسطة P3 بشكل كبير بواسطة N226-H طفرة

غالبًا ما تؤدي تفاعلات الخرائط الخلوية والفيروسية مع MTs إلى تغييرات هيكلية إجمالية في شبكات MT التي يمكن اكتشافها عن طريق تحليل المجهر الضوئي / تحليل CLSM ويعتقد أنها تتوافق مع تجميع MT 28 ، 29 ، 30 ، 31 ، 32 ، 33 ، 34 ، 35. يمكن أن توفر هذه التأثيرات وسيلة لتقدير تفاعلات MAP-MT على مستوى خيوط MT الفردية. ومع ذلك ، فإن المجهر الضوئي / CLSM محدود الانعراج بأكبر قدر ممكن من الدقة المكانية ج. 200 & # x02009nm ، مما يحول دون التحليل الكمي المباشر لخيوط MT الفردية (قطر 25 & # x02009nm) أو مدى تجميع الشعيرات. في حين أن المجهر الإلكتروني (EM) يمكنه تصور الخيوط الفردية ، وقد تم استخدامه لتأكيد نشاط التجميع لبعض MAPs 28 ، 29 ، 30 ، 31 ، 32 ، 33 ، 34 ، 35 ، فإن مثل هذه الدراسات تقتصر عادةً على مجمعات من البروتين المنقى مع في المختبر التوبولين المبلمر ، أو تحليل الخلايا التي تخضع لإجراءات تثبيت كيميائية واسعة النطاق / أوقات تحضير العينة 36 ، 37. علاوة على ذلك ، يمنع EM استخدام علامات الفلورسنت للتوطين الدقيق للهياكل / البروتينات ذات الأهمية في مجموعات الخلايا الكبيرة. وبالتالي ، لاكتشاف حزم خيوط MT الخلوية التي يسببها P3 وتحديدها بشكل مباشر ، استخدمناها دالتصوير فائق الدقة STORM ، الذي يتغلب على حد الانعراج عن طريق الكشف عن وظائف انتشار نقطة الانبعاث غير المضطربة من جزيئات مفردة ، مما يتيح توطين مكاني دقيق للغاية للفلوروفورات المنبعثة. استخدم التحليل بروتوكولات التثبيت الخلوي والمناعة المعروفة للحفاظ على سلامة MT ، والتي استخدمناها سابقًا لتصور MTs الفردية 38 ، 39 ، 40 ، مع دتم إجراء قياسات STORM باستخدام مجهر واسع النطاق فائق الدقة مصمم خصيصًا يمكنه تحقيق دقة توطين جزيء واحد أفضل من 10 & # x02009nm ، ودقة مكانية تصل إلى 20 & # x02009nm 41. تم الحصول على صور مفصلة لهندسة MT بدقة كافية للتمييز بين MTs المرتبطة ارتباطًا وثيقًا (يُفترض أن تكون حزمًا ، انظر أدناه) من MTs الفردية التي تفصل بينها عشرات النانومتر ولكنها تشغل نفس منطقة الانعراج وبالتالي لا يمكن حلها باستخدام الفحص المجهري للضوء التقليدي ( انظر الشكل التكميلي S3).

للتحليل الكمي لأبعاد الخيوط وحدوث التجميع في دصور STORM ، قمنا بحساب MT النسبي قطر الميزة (MTفد) باستخدام عرض عند نصف ارتفاع دالة غاوسية تتناسب مع المظهر الجانبي المتوسط ​​للكثافة لمقطع عرضي لميزة MT المستمرة (الشكل 4 أ). سيكون عرض خيوط MT الفردية التي تم تصويرها بهذه الطريقة أكبر من القطر الداخلي لخيوط MT (c. 25 & # x02009nm) نظرًا لأن مواقع جزيئات Alexa Fluor-647 المقترنة بالأجسام المضادة التي تم اكتشافها. وهكذا ، فإن التسمية المناعية الأولية ضد التوبولين والعلامة المناعية الثانوية المترافقة من Alex Fluor 647 (والتي تسمي جانبي الشعيرة) تضيف بعض 30 & # x0201340 & # x02009nm إلى العرض الظاهر ل MT واحد. مع أخذ هذا ودقة توطين الفلوروفورات نفسها (عادةً 9 & # x0201315 & # x02009nm في هذه القياسات) في الاعتبار ، توقعنا نطاقًا من 40 & # x02013100 & # x02009nm لـ MTs الفردية. بالاتفاق مع هذا ، أشارت المقارنة المعيارية باستخدام الخلايا المنقولة الوهمية إلى أن 72 ٪ من MTفدكانت s في هذا النطاق (انظر الشكل التكميلي S3). من المحتمل أن تكون الخيوط السميكة المكتشفة في الخلايا المصابة بالعدوى المنقولة وهمية (& # x0003e100 & # x02009nm) نتيجة التجميع الأصلي للـ MTs بالإضافة إلى اكتشاف MTs المتداخلة المنفصلة في مساحة محورية ولكن يبدو أنها مرتبطة في 2D دصورة STORM. ومع ذلك ، فإن غالبية الميزات تقع ضمن النطاق المتوقع لعدد كبير من السكان من MTs الفردية وغير المجمعة.

(أ) دصور STORM من المناعة & # x003b2-يظهر التوبولين في خلايا COS-7 التي تعبر عن البروتينات المشار إليها في الألواح العلوية. يتم توسيع المساحات المعبأة في اللوحات السفلية ، وتتناسب الوظائف الجاوسية (الخط الأسود) مع ملف تعريف الكثافة المتوسط ​​(الخط الأحمر) للخيوط المشار إليها الموضحة أدناه. مشتق MTفد (محسوبة عند نصف ارتفاع العرض الكامل لوظيفة غاوسي) يشار إليه. (ب) توزيع تردد MTفديتم عرض s المحسوبة لكل بروتين (n & # x02009 = & # x020091294 [GFP-Ni-P3] ، 1071 [GFP-Ni-CE-P3] و 1299 [GFP-Ni-P3-N226-H] القياسات مأخوذة من 10 خلايا لكل بروتين عبر فحصين متطابقين). (ج) المخططات النقطية المبعثرة لـ MTفديظهر في (ب). تم تحديد قيم p باستخدام اختبار Mann-Whitney.

أشار تحليل الخلايا التي تعبر عن GFP-Ni-P3 (الشكل 4 أ) إلى حدوث تغيير كبير في بنية MT ، مع 63.4 ٪ من MTفدs التي تتجاوز 40 & # x02013100 & # x02009nm ، و 18.1٪ تتجاوز 200 & # x02009nm (الشكل 4 ب) ، مما يدل على التجميع الواسع. إن الفكرة القائلة بأن ميزات MT الكبيرة هذه تتوافق مع الحزم المتعددة لخيوط MT الفردية مدعومة بالملاحظة التي تشير إلى أن الخيوط السميكة غالبًا ما تبدو مقسمة إلى خيوط أرق ، مع الطول المستمر للمنطقة & # x0201cbundled & # x0201d التي تشير إلى ارتباط محدد لـ MTs المكونة (انظر الشكل التكميلي S4).

بنية شبكات MT في الخلايا التي تعبر عن GFP-Ni-CE-P3 و GFP-Ni-P3-N226-H (الشكل 4 أ) كان أكثر اتساقًا مع تلك التي لوحظت في الخلايا المنقولة الوهمية منها في الخلايا التي تعبر عن GFP-Ni-P3 ، مع 78.5 ٪ (GFP-Ni-CE-P3) و 67.3 ٪ (GFP-Ni-P3) -ن226-H) من MTفدs ضمن 40 & # x02013100 & # x02009nm (الشكل 4 ب) ، مما يدل على التجميع المعيب بواسطة هذه البروتينات. ومع ذلك ، Ni-P3-N226- احتفظ H بقدرة تجميع متزايدة قليلاً مقارنةً بـ Ni-CE-P3 ، المشار إليها بواسطة & # x02009 & # x0003e & # x020092 أضعاف نسبة MTفدs في جميع صناديق توزيع التردد التي تتجاوز 140 & # x02009nm.تمشيا مع الاتجاه الملحوظ ، أشار التحليل الإحصائي إلى أن متوسط ​​MTفد للخلايا التي تعبر عن GFP-Ni-P3 كان أكبر بشكل ملحوظ (p & # x02009 & # x0003c & # x020090.0001) من ذلك لـ GFP-Ni-P3-N226-H ، والتي كانت بدورها أكبر بكثير (p & # x02009 & # x0003c & # x020090.0001) من تلك الخاصة بـ GFP-Ni-CE-P3 (الشكل 4 ج).

وهكذا ، يبدو أن N.226- H بشكل كبير يمنع التجميع ، لكنه لا يلخص تمامًا النمط الظاهري المعيب لـ Ni-CE-P3 ، بحيث تكون درجة التجميع التي تم اكتشافها بواسطة ديرتبط STORM بمدى ارتباط شبكة MT المحدد في تتبع الفتيل المستند إلى CLSM ومقايسات التوطين المشترك (الشكلان 2 و & # x200B و 3). 3). هذه البيانات تشير إلى ذلك ديوفر STORM طريقة فعالة لتحديد ارتباط البروتين- MT على مستوى الخيوط الفردية. هذا على حد علمنا هو أول تطبيق دSTORM لاستجواب تفاعل البروتين-MT وإبراز قوة دSTORM لتوضيح العمليات الأساسية في واجهة مضيف الفيروسات. معًا ، تشير البيانات إلى أن N.226-H تؤثر بشكل مباشر على ارتباط P3-MT ، بما يتوافق مع توطينه في CTD الذي يحتوي على نشاط ارتباط MT (الشكل 1).

لا يتأثر تفاعل P3 مع RABV N-protein و homodimerisation لبروتين P بواسطة الطفرات في Ni-CE

يلعب البروتين P دورًا مهمًا في تكاثر الجينوم الفيروسي ، الأمر الذي يتطلب تفاعل CTD مع البروتين النووي RABV (بروتين N) للتوسط في ارتباط بروتين P مع RNA الجينومي المغلف بالبروتين N (N-RNA الشكل 1). يتوسط CTD أيضًا التفاعل مع STAT1 (الشكل 1) ، وهو أمر مهم للوظائف المضادة لـ IFN للأشكال الإسوية للبروتين P 15 ، 16 ، 43 ، 44. تختلف مواقع الربط N- و STAT1 المبلغ عنها عن N226 44 ، 45 ، 46 ، والبيانات السابقة تشير إلى أنهم لم يتأثروا بشكل كبير بـ N226-H ، لأن فيروس Ni-CE قابل للحياة بشكل كبير في الخلايا المستزرعة ، و Ni-CE-P ليس قاصرًا لتفاعل STAT1 13. للتأكيد بشكل مباشر على أن تفاعل Ni-CE-P CTD مع البروتين N غير متضرر ، استخدمنا تحليل الخميرة -2 الهجين (الشكل 5) ، والذي تم استخدامه على نطاق واسع لتحديد وتوصيف التفاعلات ثنائية الجزيئات لبروتين P ، بما في ذلك مع N البروتين ، وكذلك P البروتين homodimerisation 47 ، 48 ، 49. يشير هذا إلى عدم وجود عيب واضح في Ni-CE مقارنة ببروتينات Ni P. يشير أيضًا التحليل 2-الهجين للتحليل المتماثل لبروتين P عبر مجال dimerization مترجم NTR 50 (الشكل 1) ، والذي ثبت أنه مطلوب لرابط P3-MT عبر CTD وللتثبيط المعتمد على MT لـ STAT1 19 ، لا يوجد عيب في Ni-CE-P (الشكل 5). وبالتالي ، لا يبدو أن الطفرات في Ni-CE ضارة بشكل عام ببنية البروتين P أو وظيفته ، مما يدل على تأثيرات محددة على تفاعل MT مثل N226يمكن تطبيق طفرة -H للتحقيق المباشر في الأهمية الوظيفية لاتحاد P3-MT.

تم تحويل خلايا الخميرة L40 للتعبير عن مجال ربط الحمض النووي لـ LexA (Lex) أو مجال تنشيط GAL4 (GAD) المدمج في Ni-P1 و Ni-CE-P1 و Ni-P3 و Ni-CE P3 و P3 المقابل. NTRs (ص54-172) ، أو بروتين RABV N. تظهر خطوط النمو ، حيث يُشار إلى تفاعل البروتينات المندمجة بـ Lex- و GAD بالتلوين الغامق للمستعمرات.

ن226-طفرة H تضعف وظيفة مناهضة IFN لـ P3 وإمراضية RABV

لفحص تأثير N.226- طفرة H على قدرة P3 على التسبب في ارتباط STAT1 مع MTs ، والخلايا التي تعبر عن GFP-fused Ni-P3 و Ni-CE-P3 و Ni-P3-N226-H تم علاجه بـ IFN & # x003b1 قبل الاستخراج السيتوبلازمي والتثبيت والتثبيت المناعي لـ STAT1 و tubulin ، والتصوير بواسطة CLSM. كان ارتباط GFP-Ni-P3 و STAT1 مع MTs قابلاً للاكتشاف بوضوح (الشكل 6 أ) ، ولكن تم تقليل ارتباط STAT1 مع MTs بشدة أو لا يمكن اكتشافه في الخلايا التي تعبر عن GFP-Ni-P3-N226-H ، ولم يكن هناك دليل على تفاعل STAT1-MT في الخلايا التي تعبر عن GFP-Ni-CE-P3 أو خلايا التحكم المنقولة للتعبير عن GFP وحده. لمزيد من تحليل تأثير N.226-H على العداء بوساطة P3 للإشارات المعتمدة على IFN & # x003b1 / STAT1 ، استخدمنا اختبار جين مراسل لوسيفيراز ، كما هو موضح سابقًا 13 ، 19 ، 44. Ni-P3 منع بقوة الإشارة استجابة لـ IFN & # x003b1 ، ولكن Ni-CE-P3 و Ni-P3-N226-H كانت ضعيفة بشكل ملحوظ (p & # x02009 & # x0003c & # x020090.0001) في هذا الصدد (الشكل 6 ب). والجدير بالذكر أن الوظيفة المضادة لـ IFN لبروتينات P3 المختلفة مرتبطة بقدرتها على الارتباط بـ MTs وتحفيز ارتباط MT لـ STAT1 (الأشكال 2 و # x200B و 3 و 3 و # x200B و 4 4 و & # x200B و 6a ) ، 6 أ) ، ومع إمراضية فيروسات Ni و Ni-CE.

(أ) تم استخراج خلايا COS-7 المعالجة بـ IFN & # x003b1 التي تعبر عن البروتينات المشار إليها قبل التثبيت والتثبيت المناعي لـ STAT1 و & # x003b2-tubulin ، والتحليل بواسطة صور CLSM يمثل 15 مجال رؤية من فحصين. (ب) تم تحليل الإشارات المعتمدة على IFN - & # x003b1 في خلايا COS-7 التي تعبر عن البروتينات المشار إليها باستخدام اختبار جين مراسل لوسيفيراز مزدوج ، كما هو موضح سابقًا. يتم التعبير عن نشاط Luciferase كتغيير أضعاف بالنسبة إلى ذلك الذي تم الحصول عليه من أجل IFN - & # x003b1- الخلايا المعالجة التي تعبر عن بروتين Ni-P3 (متوسط ​​وحدات الإضاءة النسبية [RLU] & # x02009 & # x000b1 & # x02009SEM n & # x02009 = & # x0200912 من 4 متطابقة المقاييس). تم حساب قيم p باستخدام اختبار الطالب & # x02019s.

للتحقيق مباشرة في تأثير N.226- ح عند الإصابة في الجسم الحي، أدخلنا هذه الطفرة وحدها في ني ص جين الفيروس 13 ، 21 المسبب للمرض المقاوم لـ IFN (NiP) الفيروس المؤتلف المشتق كان يسمى CE (NiP-N226-H) (الشكل 7 أ). تم تلقيح الفئران ddY (خمسة فئران لكل فيروس) داخل المخ باستخدام 100 وحدة تشكيل تركيز (FFU) من Ni-CE أو CE (NiP) أو CE (NiP-N226-H) ، وتمت مراقبته على مدار 21 يومًا بعد الإصابة (نقطة في البوصة) ، كما سبق 13. تمشيا مع الملاحظات السابقة ، كانت العدوى الوهمية بدون أعراض (لم تظهر البيانات) ، مع الإصابة بفيروس Ni-CE تسبب فقط في تغيرات خفيفة ومؤقتة في الوزن ، بينما تسبب CE (NiP) في الموت أو التضحية عند نقطة النهاية المحددة في 1 من 5 الفئران بنسبة 11 نقطة في البوصة ، و 5/5 الفئران بنسبة 14 نقطة في البوصة (الشكل 7 ب). نتيجة الإصابة بـ CE (NiP-N226-H) كان مشابهًا للعدوى بـ Ni-CE ، مما تسبب في فقدان الوزن المؤقت البسيط مع عدم ظهور الأعراض الرئيسية وعدم حدوث وفيات ، مما يشير إلى ضعف كبير (p & # x02009 = & # x020090.0027). أجرينا أيضًا عدوى باستخدام فيروس 10 6 FFU ، ووجدنا أن العدوى بواسطة Ni-CE ظلت غير قاتلة بينما استسلمت جميع الفئران المصابة بـ CE (NiP) للعدوى بمقدار 8 نقطة في البوصة. توهين كبير (p & # x02009 = & # x020090.0052) من CE (NiP-N226-H) لوحظ زيادة FFU ، حيث استسلمت 3/5 فئران فقط بمقدار 14 نقطة في البوصة بينما أظهرت الفئران المتبقية زيادة في الوزن من 11 نقطة في البوصة.

(أ) التمثيل التخطيطي لجينومات الفيروسات المستخدمة من الجينات من Ni و Ni-CE بالأبيض والأسود ، على التوالي. ال ص يتم استبدال جين Ni-CE بـ ص جين Ni في CE (NiP) ، وللنسخة المحورة من Ni ص الجين الذي يحتوي على N.226-H في CE (NiP-N226-H). (قبل الميلاد) 100 (ب) أو 10 6 (ج) تم تلقيح FFU للفيروس المشار إليه داخل الدماغ في الفئران (خمسة فئران لكل حالة) ووزن الجسم بالنسبة لذلك عند 0 نقطة في البوصة (متوسط ​​وزن الجسم النسبي & # x02009 & # x000b1 & # x02009SEM ، للفئران الحية) وتم رصد البقاء على قيد الحياة أكثر من 21 أو 14 نقطة في البوصة. تم حساب قيم p لمنحنيات البقاء على قيد الحياة باستخدام اختبار رتبة السجل (Mantel-Cox). & # x02020 جميع الفئران ميتة أو ضحية عند الوصول إلى نقطة النهاية.

مجتمعة ، تشير بياناتنا إلى أن N.226- طفرة H تضعف قدرة P3 على التفاعل مع MTs وتأثير العداء للإشارات المضادة للفيروسات ، وتقلل بشدة من قدرة RABV على التسبب في عدوى مميتة في الفئران. تتوافق هذه النتائج مع الأدوار الرئيسية لخصم IFN المعتمد على MT من خلال واجهة P3-MT في الإمراضية لـ RABV ، مما يدعم الفرضية القائلة بأن تفاعلات البروتين الفيروسي-MT لها أدوار مهمة في تخريب بيولوجيا المضيف المتميزة عن الوظائف الراسخة لـ MTs في تهريب الفيروسات 9. الأهم من ذلك ، ملاحظة أن تعديل هذه التفاعلات يمكن أن يؤثر على نتائج المرض في الجسم الحي يحدد الأهداف المحتملة الجديدة على واجهة الفيروس-MT التي يمكن أن تسهم في تطوير اللقاحات الموهنة و / أو الأدوية المضادة للفيروسات لمكافحة العدوى بالفيروسات الليزوزية ، التي تسبب مرض داء الكلب مع معدل إماتة للحالات يبلغ 100٪ تقريبًا ولا توجد خيارات علاجية فعالة 51.


اقتناء الصور المتقدمة والأساليب التحليلية لدراسات الخلايا الحية وأقسام الأنسجة

الدراسات على العينات الثابتة أو التحليلات على مستوى الجينوم للعمليات النووية مفيدة لتوليد لقطات من مجموعة الخلايا في نقطة زمنية معينة. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب التجريبية لا توفر معلومات على مستوى الخلية الواحدة. لا تستطيع الدراسات على مستوى الجينوم تقييم التباين بين الخلايا الفردية التي يتم تربيتها في المختبر أو التي تنشأ من مراحل مرضية مختلفة. الكيمياء الهيستولوجية المناعية والتألق المناعي هما نهجان تجريبيان أساسيان في المختبرات السريرية ويستخدمان أيضًا على نطاق واسع في الأبحاث الأساسية. ومع ذلك ، قد ينتج عن إجراء التثبيت قطع أثرية ويمنع مراقبة ديناميات العمليات النووية. لذلك ، يعد تصوير الخلايا الحية أمرًا بالغ الأهمية لدراسة حركية الأحداث النووية الأساسية ، مثل تكرار الحمض النووي والنسخ والربط وإصلاح الحمض النووي. تركز هذه المراجعة على التحليلات المجهرية المتقدمة للخلايا ، مع التركيز بشكل خاص على الخلايا الحية. نلاحظ بعض الابتكارات المنهجية والخيارات الجديدة لأنظمة المجهر التي يمكن استخدامها أيضًا لدراسة أقسام الأنسجة. كما تمت مناقشة طرق حجر الأساس للبحث الفيزيائي الحيوي للخلايا الحية ، مثل استعادة التألق بعد التبييض الضوئي ونقل طاقة الرنين الفلوري ، وكذلك الدراسات حول تأثيرات الإشعاع على المستوى الخلوي الفردي.


تعمل الكتلة الحيوية المشتقة من جدار الخلية النباتية كمصدر متجدد للطاقة والمواد ذات الأهمية المتزايدة. جدران الخلايا عبارة عن تجمعات جزيئية حيوية يتم تحديدها من خلال ترتيب دقيق لفئات مختلفة من السكريات والبروتيوغليكان والبوليمرات العطرية وهي واحدة من أكثر الهياكل تعقيدًا في الطبيعة. تتمثل إحدى المهام الأكثر تحديًا لبيولوجيا الخلية وأبحاث التكنولوجيا الحيوية للكتلة الحيوية في تصوير هيكل وتنظيم هذه المصفوفة المعقدة ، بالإضافة إلى تصور آليات التركيب الحيوي المجزأة والمتعددة اللاعبين التي تبني بنية جدار الخلية المعقدة. تعد المعرفة الأفضل بالخلايا النباتية وجدران الخلايا والأنسجة الكاملة ضرورية لجهود الهندسة الحيوية ولتصميم استراتيجيات فعالة للتفكيك الصناعي للكتلة الحيوية المشتقة من جدار الخلية وتكسيرها. تعد التحليلات الجزيئية الموجهة لجدار الخلية والتحليل بواسطة الفحص المجهري الضوئي ، القادر على التصوير بمستوى عالٍ من الخصوصية ، ومعالجة صغيرة للعينات ، وغالبًا في الوقت الفعلي ، أدوات مهمة لفهم تجمعات جدار الخلية. تقدم هذه المراجعة نظرة عامة شاملة حول إمكانيات تقنيات التصوير المبني على الملصق الفلوري ومجموعة متنوعة من طرق الفحص ، وتناقش الأدوات الراسخة والناشئة على حد سواء. يتم توفير أمثلة على تطبيقات هذه الأدوات. نقوم أيضًا بإدراج ومناقشة مزايا وقيود الأساليب. على وجه التحديد ، نوضح ما هي أهم الاعتبارات عند تطبيق تقنية معينة للنباتات ، وإمكانية التطور المستقبلي ، وكيف يمكن أن يكون مجال جدار الخلية النباتية مستوحى من التقدم في مجالات الطب الحيوي وبيولوجيا الخلية العامة.

يعتمد نمو النبات على قدرة النباتات على تحويل ثاني أكسيد الكربون إلى سكريات عن طريق التمثيل الضوئي واستقلابها إلى مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية الأخرى [1]. حوض الكربون الرئيسي في النباتات هو جدار الخلية ، وهو عبارة عن مصفوفة خارج الخلية تتكون من جليكانات طويلة السلسلة ، وبروتينات سكرية ، وبوليمرات فينولية وبوليستر ، بالإضافة إلى مواد مذابة وماء. توفر جدران الخلايا وظائف هيكلية ووقائية مهمة للنباتات كما تساهم في الجزء الأكبر من كتلتها الحيوية [2]. قد يتم اشتقاق عدد كبير من المنتجات ، مثل الوقود الحيوي ، والمواد الكيميائية ، والورق ، والمواد الجديدة من هذه الكتلة الحيوية ، وسيكون إيجاد نهج مستدامة ومحايدة للكربون للقيام بذلك جزءًا مهمًا من تحويل مجتمعنا بعيدًا عن الأحفوري- الاقتصاد القائم على الوقود [3]. نتوقع أن تكون هذه الجهود مدعومة بفهم أفضل لكيفية تنظيم هذه الكتلة الحيوية ، وكيف يتم إنشاؤها بواسطة النبات ، وما يحدث أثناء معالجتها ، ومناقشة مجموعة الأدوات المتاحة لإنجاز هذه الدراسات باستخدام الفحص المجهري الفلوري في هذا إعادة النظر.

المكونات الرئيسية لجدران الخلايا النباتية هي السكريات ، والتي تنقسم إلى ثلاث فئات مختلفة: السليلوز ، الهيميسليلوز ، والبكتين [4 & # x020136]. يتكون السليلوز من الجلوكوز المرتبط & # x003b2 -1،4 الذي يتحد في الألياف الدقيقة عبر روابط الهيدروجين بين الجزيئات وقوى van der Waal & # x02019s. تتمتع ألياف السليلوز الدقيقة بقوة شد عالية وتعمل كسقالة ، مما يوفر قوة تحمل لجدران الخلايا [7 ، 8]. يتم إنتاج السليلوز على سطح الخلية بواسطة معقدات بروتين السليلوز سينثيز (CesA) ، والتي تستخدم جلوكوز UDP العصاري الخلوي كركيزة [9 ، 10].

يتكون Hemicellulosis بشكل أساسي من & # x003b2 -1،4 العمود الفقري المحايد للسكر المرتبط بتكوينات استوائية ويتضمن xyloglucan و xylan و mannan و glucomannan وجلوكان مختلط الارتباط [5]. تصنع هذه البوليمرات في لومن جولجي ، باستثناء محتمل جلوكان المرتبط المختلط [11 & # x0201313] ، بواسطة غليكوزيل ترانسفيرازات (GTs) التي تستخدم مجموعة من السكريات النوكليوتيدية كركائز. تتفاعل Hemicellulosis مع السليلوز و / أو اللجنين لتنظيم ، اعتمادًا على السياق التنموي ، إما تمدد جدار الخلية ونمو الخلية أو تصلب جدار الخلية [8 ، 14 ، 15].

تصنع البكتين أيضًا في Golgi lumen بواسطة GTs وهي من أكثر جزيئات جدار الخلية تعقيدًا وديناميكية. Homogalacturonan (HG) ، وهو بوليمر متجانس من & # x003b1 -1،4 مرتبط بحمض الجالاكتورونيك ، يتم تصنيعه في شكل عالي الأسترة الميثيل وعند إفرازه في جزء السكتة الدماغية يمكن فصله عن طريق فئة من الإنزيمات تسمى pectin methylesterases (PMEs) . يعد تعديل نشاط PME أساس العمليات الخلوية والتنموية الموجهة لجدار الخلية ، على سبيل المثال ، تكوين النسيج الإنشائي أو تشكل خلايا الرصف [16 & # x0201318]. يمكن تزيين العمود الفقري لـ HG بالسكريات الأحادية مثل apiose (apiogalacturonan) ، أو xylose (xylogalacturonan) ، أو بتشكيلة معقدة من السكريات والروابط الجليكوسيدية المعروفة باسم rhamnoglacturonan II (RG-II). البكتين الآخر ذو العمود الفقري لتكرار ثنائي السكاريد من حمض الجلاكتورونيك ووحدات رامنوز هو rhamnogalacturonan I (RG-I) ، والذي تم تعديله بشكل أكبر مع سلاسل جانبية galactan و arabinan. توفر الميثيل والأسيتيل للبكتين ميزات جزيئية مهمة أخرى تؤثر على معالجة الكتلة الحيوية وقابلية التخمير [19 ، 20].

على عكس جدران الخلايا الأولية المرنة التي تغلف الخلايا التي لا تزال تنمو ، تترسب جدران الخلايا الثانوية السميكة بمجرد توقف الخلايا عن النمو. توفر هذه الجدران القوية قوة ميكانيكية بالإضافة إلى تكوين أنسجة الأوعية الدموية اللازمة لنقل المياه وتوفير مقاومة للتهديدات الحيوية [21]. تشكل جدران الخلايا الثانوية الجزء الأكبر من الكتلة الحيوية للنبات وهي المصدر الرئيسي للسكريات القابلة للتخمير لإنتاج الوقود الحيوي السليلوزي [22]. عنصر بارز في العديد من جدران الخلايا الثانوية هو اللجنين ، وهو بوليمر فينولي غير متجانس للغاية يتم بلمرة مباشرة في جدار الخلية عن طريق اللاكسيس والاقتران الجذري بمساعدة البيروكسيديز للكحولات العطرية الصغيرة المعروفة باسم المونوليجنول [23]. يعزز هذا الارتباط المتشابك الواسع جدران الخلايا ، لكن اللجنين نفسه يعمل أيضًا كحاجز أساسي كاره للماء على أوعية نسيج الخشب لتمكين نقل المياه لمسافات طويلة.

بسبب وفرة اللجنين واتساع نطاق تشابكه ، عادة ما يكون اللجنين هو العامل الرئيسي الذي يؤثر على مقاومة جدران الخلايا للتحلل. ومع ذلك ، لا يزال تمرد الكتلة الحيوية للمعالجة ظاهرة غير مفهومة جيدًا وتتأثر أيضًا بمورفولوجيا جدار الخلية والمسامية ووفرة البوليمرات المكونة المتغيرة [24 & # x0201327]. يمكن استخدام التصوير المعتمد على التألق لتقييم هذه الميزات في كل من جدران الخلايا الأصلية والعينات المعالجة ، وإظهار أشياء مثل النطاقات الدقيقة لجدار الخلية ، وإمكانية الوصول إلى الآلات الأنزيمية ، أو تأثيرات العلاجات الفيزيائية أو الكيميائية على العينة [28 ، 29].

هناك عدد قليل من طرق التصوير التي تستخدم الخصائص الكيميائية أو الميكانيكية الجوهرية لبوليمرات جدار الخلية ، مثل الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) ، والتنظير المجهري بالأشعة تحت الحمراء (FTIR) ، وتنظير رامان المجهري متحد البؤر (CRM) ، ومضاد ستوكس رامان المتماسك مجهر التشتت (CARS) ، تحفيز Raman التشتت المجهري (SRS) ، مجهر Brillouin ، والتصوير المقطعي بالأشعة السينية (CT) [29 ، 30]. على الرغم من أن هذه التقنيات خارج نطاق هذه المراجعة ، فمن المتوقع أن تكون مفيدة بشكل خاص لتوصيف العينات ذات المجموعات الوظيفية غير العادية أو الكثافة الإلكترونية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تلخيص بعض الأساليب القائمة على الفلورة مثل الفحص المجهري لنقل طاقة الرنين F & # x000f6rster والتصوير المجهري مدى الحياة (FLIM) مؤخرًا بشكل جيد في مراجعات أخرى [30 ، 31] ، لذلك نحن لا نناقش المعلومات الفيزيائية الحيوية الخاصة التي يقومون بها يمكن أن تقدم هنا ولكن لاحظ أنها تشترك في العديد من نفس التحديات مثل التصوير الفلوري القياسي ووضع العلامات الجزيئية.

تنقسم هذه المراجعة إلى قسمين رئيسيين: الجزء الأول يناقش خيارات تصور جدار الخلية من خلال أنواع مختلفة من الفحص المجهري الفلوري ، ويتعامل القسم الثاني مع الجزيئات التي تمكن خارجي أو داخلي المنشأ & # x02018tagging & # x02019 أهداف جزيئية محددة. تأتي جميع طرق البحث مع قيودها وعيوبها وتحدياتها ، ونحن نستخدم هذه الفرصة لتسليط الضوء عليها بشكل خاص. نقترح أيضًا كيف يمكن للتطورات المستقبلية والتطورات في هذا المجال أن تخفف من العوائق والمزالق الحالية.


الشكل 6

الشكل 6. صور مضان متحد البؤر (75 ميكرومتر × 75 ميكرومتر) من Hoechst 33258 (وصمة عار نووية) + 10 ميكرومتر 1 بعد 24 ساعة من الحضانة.

للتلخيص ، تم تصنيع المثال الأول لمركب مرتبط بـ M-M يشتمل على فلوروفور عضوي. النتائج الحالية مع المركب 1 تشير إلى أنه يمكن تمييز مركبات الدروديوم بمجسات الفلورسنت وأن التوطين داخل الخلايا تمليه على الأقل جزئيًا بواسطة المركب المعدني المربوط منذ نمط التوزيع الخلوي لـ 1 يختلف عن يجند الفينبوديبي المجاني. مجمع 1 وجد أنه يستهدف بشكل رئيسي الجسيمات الحالة والميتوكوندريا بتركيزات تتراوح من 1 إلى 100 ميكرومتر ، مع تفضيل طفيف للعضية السابقة (∼1.4 ضعف). على عكس المركب وثيق الصلة 2 (انظر التركيب الجزيئي في الشكل S1) ، الذي يستهدف النواة ويؤدي إلى تلف الحمض النووي ، مركب 1 لا يتمركز في نوى خلايا A549 ، وهو دليل يدعم الزعم القائل بأنه يمكن استهداف العديد من العضيات الخلوية عن طريق ضبط روابط وحدة الدروديوم. في هذا السياق ، يتم إجراء المزيد من الدراسات في مختبراتنا لتعديل طبيعة ودهون الفلوروفور ، لتغيير موضعه بالنسبة إلى نواة الدروديوم (الارتباط الاستوائي مقابل الارتباط التساهمي بروابط الكربوكسيل التجسير) من أجل تحسين الامتصاص والسمية الخلوية من هذا النوع الجديد من مركب الدرهوديوم الفلوري. في النهاية ، الهدف هو الحصول على نظرة أعمق للخصائص المضادة للسرطان لهذه الفئة المثيرة للاهتمام من المركبات المرتبطة بـ M-M. علاوة على ذلك ، توفر الدراسة الحالية حافزًا لاستكشاف الخصائص البيولوجية للمجمعات غير العضوية متعددة المراكز الأخرى ، حيث يمكن استخدام نفس الاستراتيجية لتسمية مركبات diruthenium (28) و dirhenium (29) المضادة للسرطان. تجدر الإشارة إلى أن إدراك أن المركبات المرتبطة بعامل Rh-Rh يمكن تمييزها بنجاح بوحدات حصاد الضوء مثل الجسم سيؤثر بشكل إيجابي على مجالات البحث الأخرى ، مثل استخدام مركبات الدروديوم كمحفزات ضوئية ، (30-32) منذ الربط من المتوقع أن يؤدي جزء ذو امتصاص مولاري عالٍ إلى النواة الثنائية إلى تحسين كفاءة مثل هذه الأنظمة التحفيزية.


صورة المعاهد الوطنية للصحة: ​​استخدم في التصوير المجهري الإسفار ومتحد البؤر

تم دعم العمل الذي أدى إلى هذا الدليل من خلال المنح المقدمة إلى H.J.Karten من NIMH و NINDS و NEI. تم إعداد هذا الدليل بدعم مباشر من NIMH ومشروع الدماغ البشري ومشروع قاعدة بيانات الدماغ. تحت ضغط محاولات الحصول على دعم المنح ، غالبًا ما نهمل تقديم الشكر الكافي للعديد من العلماء المتفانين الذين يعملون بجد لإنشاء تلك البرامج التي توفر الأموال اللازمة. هذا الدليل مخصص لأولئك الداعمين المخلصين لنا جميعًا في المعاهد الوطنية للصحة و NSF و DOD و NASA وأماكن أخرى.

لقد قمت بتبني وتعديل عدد من وحدات الماكرو التي ساهم بها العديد من مستخدمي صور المعاهد الوطنية للصحة. غالبًا ما كان من الصعب تحديد تأليف وحدات الماكرو الأصلية. أنا ممتن للمؤلفين غير المعترف بهم ، وآمل ألا يتعرضوا للإهانة إن لم يتم الاعتراف بهم على وجه التحديد. شكري الخاص إلى Rusty Gage و Larry Goldstein لتزويدهم بوصول غير محدود إلى مرافق المجهر متحد البؤر. لولا كرمهم ، لما كان هذا الدليل ممكنًا.

يرجى إعلامي إذا كان هذا الدليل مفيدًا. الرجاء إعلامي بأي أخطاء في هذا الدليل. إذا كان لديك أي اقتراحات لتحسين هذا الدليل ، أو وحدات ماكرو إضافية مفيدة لمعالجة الصور البؤرية ، أو استراتيجيات أخرى لمعالجة صور CLSM ، فيرجى إبلاغي بذلك ، وسأحاول دمج هذه التغييرات في الإصدارات المستقبلية.

مبائر سعيدة ،
هارفي جيه كارتن ، (دكتور في الطب)
[email protected]

صورة المعاهد الوطنية للصحة هي أداة مفيدة لتقييم المواد الفلورية قبل فحصها على مجهر متحد البؤر وللمعالجة اللاحقة لصور مجهر المسح بالليزر (CLSM). قد يجد المستخدم المتمرس في NIH Image العديد من هذه العمليات واضحة. ومع ذلك ، فإن العديد من مستخدمي CLSM ، الذين لم يكونوا على دراية سابقًا بـ NIH Image سيجدون أنها أداة مفيدة لمعالجة الصور قبل وبعد الاستحواذ. آمل أن يوفر هذا الدليل مقدمة سهلة نسبيًا لاستخدام صورة المعاهد الوطنية للصحة لمستخدمي CLSM.

سيؤدي إجراء معالجة ما بعد الاستحواذ للصور على جهاز Macintosh إلى تحرير أداة متحد البؤر لجمع الصور. على الرغم من أنها ليست واسعة النطاق مثل VoxelView أو Analyze أو VolVis أو SYNU أو VoxBlast ، لا سيما في التطبيقات التي تتطلب عرضًا متقدمًا لحجم التخزين وحسابات تستند إلى Voxel ، واستخدام NIH Image و Adobe Photoshop 3.0 (Adobe Systems Inc. ، Mountain View ، CA) على PowerPC سيوفر معظم الوظائف اللازمة لمعالجة الصور البؤرية وبسعر أقل بكثير.

هذا الدليل مخصص للاستخدام مع NIH Image ، الإصدار 1.60 أو أحدث. لن تعمل العديد من الإجراءات الموضحة في الدليل بشكل صحيح في الإصدارات السابقة. يمكنك الحصول على نسخة من أحدث إصدار من صورة المعاهد الوطنية للصحة من موقع FTP: zippy.nimh.nih.gov (تسجيل الدخول: كلمة المرور المجهولة: & ltyour عنوان البريد الإلكتروني & gt cd / pub / image) أو موقع الويب المرتبط (http: // rsb. info.nih.gov/nih-image/).

1. صورة NIH على Macintosh و PC / Windows 95

يصف هذا الدليل استخدام NIH Image على جهاز Macintosh. من حيث المبدأ ، يجب أن يكون قابلاً للتطبيق بشكل كامل على نسخة من صورة NIH التي يتم إعدادها لجهاز الكمبيوتر / Windows 95.

يرعى Tod Weinberg من شركة Scion Corporation (Frederick ، ​​MD) نقل صورة NIH إلى جهاز الكمبيوتر / Windows95. هذا هو & quotport & quot مباشرة صورة المعاهد الوطنية للصحة - أي ، يجب أن يكون لها الشكل والمظهر الدقيق لصورة المعاهد الوطنية للصحة لنظام التشغيل Macintosh ، باستثناء ميزات نظام التشغيل التي تعكس الأنظمة الأساسية الفردية. في هذا الوقت (أكتوبر ، 1996) ، لا تزال ImagePC (صورة NIH للكمبيوتر الشخصي) قيد اختبار ألفا ، وبعض العمليات لا تعمل بعد ، ولكنها متاحة للتنزيل بواسطة الأفراد المهتمين. وهي متوفرة من نفس الموقع الذي يوفر صورة NIH لنظام التشغيل Macintosh ، سواء من موقع FTP أو موقع الويب. يبدو & quotport & quot من البرنامج على جهاز الكمبيوتر واعدًا للغاية ، ونأمل أن يسمح الإصدار النهائي للمستخدمين بأداء نفس العمليات على جهاز الكمبيوتر الشخصي وماكنتوش بمرافق متساوية.

2. محتويات هذا الدليل

أ) كيفية استخدام صورة المعاهد الوطنية للصحة لتقييم جودة المقاطع النسيجية الفلورية المفردة أو المتعددة المسمى في التحضير للفحص المجهري متحد البؤر.

ب) كيفية نقل الملفات من BioRAD أو Leica أو Zeiss CLSM إلى NIH Image ، سواء الصور الفردية أو السلسلة Z.

ج) كيفية استخدام صورة المعاهد الوطنية للصحة لمعالجة الصور وتحليلها: توفر صورة المعاهد الوطنية للصحة نطاقًا واسعًا من الوظائف لتحليل الصور ومعالجتها ، بما في ذلك تغيير قيم التباين والسطوع ، وصور الألوان الزائفة ، والتناوب ، والقص ، والقياس ، وعمليات التصفية المختلفة ، وقياس الكثافة ، تقطيع الكثافة وقياس الطول والمساحة وملف الخط وعد الجسيمات. هذه أدوات مفيدة لتعديل وتحليل الصور (كنفوكل). تندرج هذه الوظائف في فئة معالجة الصور الأكثر عمومية ، وتتم مناقشتها بإسهاب في دليل صور المعاهد الوطنية للصحة ، حول صورة المعاهد الوطنية للصحة.

د) كيفية استخدام نوافذ متعددة ، Z-series و Stacks: يسمح لك Macintosh بفتح العديد من النوافذ ، كل منها يحتوي على صورة متحد البؤر مختلفة. هذا يسهل مقارنة الصور المختلفة. تعد وظائف Stacks المختلفة من بين أقوى ميزات NIH Image. تتيح لك وظيفة NIH Image Stacks التنقل سريعًا ذهابًا وإيابًا عبر سلسلة Z من الأقسام. يمكنك اقتصاص هذا المكدس لتحديد ميزات معينة تهمك. يمكنك أيضًا استخدام وظيفة Stacks لمقارنة الصور المختلفة بسرعة وبالتناوب.

هـ) كيفية & quot مشروع & اقتباس جميع اللوحات (أو فقط عدد محدد من اللوحات) لسلسلة Z على مستوى واحد.

و) كيفية إنشاء صور ثلاثية الأبعاد ودورات ثلاثية الأبعاد: تسمح لك صورة المعاهد الوطنية للصحة بإنشاء سلسلة ثلاثية الأبعاد من الصور من سلسلة Z. يمكنك عرضها في نافذة مونتاج أو تصنيع أزواج استريو أو تحريكها لإضفاء مظهر تدوير كائن ثلاثي الأبعاد في الفضاء.

ز) كيفية دمج المقاطع المزدوجة والثلاثية المسمى ، وإنتاج ثلاث صور ملونة (RGB) مع صورة المعاهد الوطنية للصحة.

ح) كيف يمكن لصورة المعاهد الوطنية للصحة أن تولد سلسلة ثلاثية الأبعاد مزدوجة / ثلاثية لأزواج الاستريو والدوران.

3. بعض اعتبارات الأجهزة

أثبتت أجهزة كمبيوتر Macintosh أنها مناسبة بشكل خاص لتطبيقات الرسومات. يسمح نموذج الذاكرة 32 بت الخاص بهم باستخدام كميات كبيرة من ذاكرة الوصول العشوائي (RAM) للمعالجة السريعة لملفات الصور. أثبتت أجهزة الرسوم ونظام التشغيل أنها مناسبة جدًا لمعالجة الصور. يمكن تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في هذا الدليل على & quotlow end & quot لماكنتوش ، مثل Mac IIci و IIfx إلى الأجهزة ذات المستوى المتوسط ​​مثل سلسلة 68040 Quadra ، وبالطبع ستعمل بشكل جيد للغاية على سلسلة PowerPC من الآلات. تم تطوير معظم الإجراءات الموصوفة في هذا الدليل باستخدام Quadra 950. تتوفر إصدارات منفصلة من NIH Image ، محسّنة لسلسلة 680X0 ، بالإضافة إلى إصدار واحد & quot؛ ثنائي & quot؛ ثنائي تم تحسينه لكل من 680X0 و PowerPC. كلا الإصدارين متاحان الآن من موقع FTP. أقل تكلفة بكثير من العديد من محطات عمل الرسومات المخصصة ، مثل Silicon Graphics Indy ^ 2 ، ستختلف تكلفة Macintosh المجهز بالكامل في السعر بناءً على بعض المتغيرات المدرجة أدناه. ستعمل صورة المعاهد الوطنية للصحة بشكل مناسب على أي جهاز Macintosh حالي.

ستلاحظ الاختلافات الرئيسية في الأداء عند إنشاء سلسلة دوران ، أو قطع سلسلة Z ، أو تطبيق مرشحات مختلفة. ليس من الضروري أن يكون لديك 68040 مع معالج الفاصلة العائمة (FPU). ومع ذلك ، من أجل تحسين أداء السرعة ، فإن PowerPC 7100 أو 8500 أو 9500 سيكون أكثر جاذبية. لا يحتوي جهاز 6100 على مساحة لأداة التقاط الإطارات أو بطاقة إخراج الفيديو لطابعات الفيديو أو شريط VHS. إذا كان لديك الأموال ، فمن الواضح أن وحدة 9500/200 MHz هي الأفضل. يحتوي الجهازان 8500 و 9500 على منافذ SCSI-2 سريعة لنقل ملفات البيانات بسرعة بين الأجهزة الخارجية ، وشبكة إيثرنت مدمجة للاتصال ، ويمكن تزويدهما ببطاقة عرض رسومات عالية السرعة. NIH Image لا يدعم ماكنتوش متعدد المعالجات.

نظرًا لأننا نجمع المزيد من الخبرة في استخدام NIH Image على منصة PC / Windows 95 ، ستتضمن الإصدارات المستقبلية من هذا الدليل تعليقات ذات صلة بهذا النظام الأساسي. بناءً على الاعتبارات الأولية ، نقترح استخدام Pentium سريع (على سبيل المثال ، Pentium Pro 200) ، بكميات كبيرة من ذاكرة الوصول العشوائي وبطاقة رسومات سريعة 24 بت وقرص صلب كبير وشاشة RGB مقاس 20 بوصة.

أ) نظام التشغيل

استخدم نظام 7.1 أو أعلى. النظام 7.5.5 مستقر تمامًا ، ونحن نستخدمه الآن بشكل روتيني.

ب) رسومات RAM والشاشات

NIH Image هو برنامج 8 بت. ومع ذلك ، بدءًا من الإصدار 1.56 ، سيتم تشغيل صورة NIH حتى إذا كانت الشاشة في وضع 24 بت. يسمح هذا بالتبديل السريع بين Adobe Photoshop 3.0 (برنامج 24 بت) و NIH Image. من أجل الحصول على صورة كاملة 24 بت على شاشة مقاس 20 بوصة (بدقة 1024 × 768 أو أعلى) ، يجب تعبئة بطاقة عرض الرسومات الموجودة على PowerPC بـ 4 ميجا بايت من VRAM للسماح بالألوان 24 بت على شاشة 20 بوصة . توفر شاشة Apple Trinitron مقاس 20 بوصة multisynch صورة ممتازة ، وهي أيضًا الشاشة الأقل سعرًا مقاس 20 بوصة بالنسبة لحجم الصورة وجودتها. ومع ذلك ، ستعمل جميع العمليات الموضحة في هذا الدليل على شاشة مقاس 14 بوصة ذات 8 بت. يسمح 7100 و 6100 فقط بسعة 2 ميجابايت من VRAM ، وبالتالي ستقتصر على استخدام شاشة مقاس 17 بوصة ذات ألوان 24 بت.

ج) ذاكرة الوصول العشوائي مقابل. ذاكرة افتراضية

ستحتاج إلى كميات كبيرة من ذاكرة الوصول العشوائي لتحقيق الأداء الأمثل. أقترح ما لا يقل عن 32 ميغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي ، وأكثر إذا كنت تستطيع ذلك. تجنب الذاكرة الظاهرية إذا كان ذلك ممكنًا. (ومع ذلك ، توصي Apple بتعيين 1 ميغابايت من الذاكرة الظاهرية عند استخدام System 7.5.x على PowerPC.) ملفات الرسومات كبيرة ، وغالبًا ما تكون سلسلة Z متحد البؤر ضخمة. إذا كان لديك أيضًا مرحلة آلية وقمت بعمل طائرات XY ممتدة من سلسلة Z ، فمن المحتمل أن تكون ملفاتك 30-50 ميجابايت أو أكبر وسيتعين عليك التصالح مع شراء ما لا يقل عن 80-256 ميجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي إذا كنت تريد للتحرك أسرع من نهر جليدي. الحد الأدنى من القواعد الأساسية هو أنه يجب أن يكون لديك ذاكرة وصول عشوائي تزيد بمقدار 2.5-3 مرات عن حجم أكبر ملفاتك. يجب أن تتعلم أيضًا كيفية تخصيص هذه الذاكرة لاستخدام صورة المعاهد الوطنية للصحة يحصل على معلومات . وإلا فلن تفيدك الذاكرة الإضافية. أقترح عليك تخصيص ما لا يقل عن 24 ميجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي إلى NIH Image ، و 24 ميجابايت أخرى لبرنامج Adobe Photoshop. العب مع البرنامج. يستخدم العديد من الأشخاص RAM Doubler للتعويض عن كميات محدودة من ذاكرة الوصول العشوائي. ليس لدي أي خبرة مع هذا البرنامج وسمعت تقارير مختلطة فيما يتعلق بقيمة العمل مع ملفات الرسومات الكبيرة.

د) الأقراص ووسائط التخزين

ستحتاج إلى وسائط تخزين ذات سعة كبيرة. لكنني أفترض أنه إذا كنت تعمل مع صور متحد البؤر ، فقد كان عليك بالفعل التعامل مع هذه المشكلة. مطلوب قرص صلب لا يقل عن 500 ميغا بايت. لمزيد من المرونة ، يُقترح قرص نظام بحجم 1 جيجابايت وقرص مغناطيسي ضوئي بحجم 500 ميجابايت أو أكبر لملفات البيانات الخاصة بك. قد تجد أنه من المفيد نقل الملفات الأكبر حجمًا من جهاز مغناطيسي ضوئي أبطأ إلى القرص الثابت للنظام عند العمل عليها. ثم انقلها مرة أخرى إلى المغناطيسية الضوئية للتخزين طويل المدى. قد تتجاوز سلسلة Z متحد البؤر 25 ميغا بايت بسهولة. يجب أن يكون لديك مساحة تخزين كافية على القرص الثابت لديك للسماح لك بحفظ كل من الملف الأصلي وأي تعديلات قد تجريها أثناء جلسة العمل. غالبًا ما نجد أننا نستخدم أكثر من 75 ميجابايت لكل سلسلة Z في جلسة واحدة.

ه) ملحقات

بضع كلمات حول امتدادات النظام الذكية هذه على Macintosh - الإضافات التي تصنع الشاي أثناء قيامك بحساب أو الاستجابة للأوامر الصوتية (مثل PlainTalk من Apple). لا تعمل هذه الإضافات على تشتيت المساحة فحسب ، بل والأسوأ من ذلك ، أنها تحول PowerPC إلى دبس السكر أثناء البحث باستمرار عن المدخلات الصوتية ، وفقدان دورات وحدة المعالجة المركزية ، وما إلى ذلك. قم بإيقاف تشغيلها جميعًا. ابق مع الأساسيات. عندما تقوم بمعالجة الصور ، قم بإيقاف تشغيل & quot مشاركة الملفات & quot. إذا قرر شخص آخر على الشبكة إلقاء نظرة سريعة على دليلك ، فسيتم تشتيت انتباه جهازك وإبطاء الأمور. ستظل قادرًا على العودة إلى الشبكة بنقرة مفتاح ، ولكن لن يعيقك المتفرجون الفضوليون. تعتاد على الحوسبة المخصصة ، كما في الأيام الماضية ، إذا كنت ترغب في الحصول على نتائجك بأسرع ما يمكن.

4. تحميل صورة المعاهد الوطنية للصحة ووحدات الماكرو متحد البؤر

تمت كتابة هذا الدليل بافتراض أن القارئ على دراية بنظام تشغيل Macintosh 7.1 أو إصدار أحدث.

تأكد من تخصيص ذاكرة كافية لصورة المعاهد الوطنية للصحة لإجراء العديد من العمليات الموضحة. بالإضافة إلى تخصيص ذاكرة للبرنامج كما هو موضح أعلاه ، باستخدام امتداد ملف عنصر القائمة، يحصل على معلومات، يجب عليك أيضًا تخصيص ذاكرة كافية لصورة المعاهد الوطنية للصحة & quot ؛ تراجع & amp ؛ حجم المخزن المؤقت للحافظة & quot ، الموضح أسفل خيارات + تفضيلات عنصر القائمة. أقترح 1400 كيلوبايت كحد أدنى. يجب عليك بعد ذلك تفضيلات التسجيل تحت ملف قائمة. قريب البرنامج و اعادة البدء البرنامج.

يجب نسخ الملف المصاحب & quotConfocal Macros & quot إلى المجلد (الدليل) الذي يحتوي على وحدات ماكرو الصورة NIH الأخرى. حدد ملف العروض الخاصة القائمة و تحميل وحدات الماكرو غرض. حدد & quotConfocal Macros & quot من مربع الحوار الناتج.

يحتوي الملف & quotConfocal Macros & quot على سلسلة من وحدات الماكرو المفيدة بشكل خاص لمعالجة أزواج المقاطع ذات العلامات المزدوجة ، وسلسلة Z ، وإنشاء أزواج استريو. يجب أن يتعرف القارئ أيضًا على استخدام الأكوام في صورة المعاهد الوطنية للصحة ، كما هو موضح في حول صورة المعاهد الوطنية للصحة.

يتم تضمين نسخة من ملف وحدات الماكرو في الملف binhexed & quot / pub / image / documents / confocals.hqx & quot المقدمة عبر FTP. ومع ذلك ، بالنسبة لأولئك المستخدمين الذين حصلوا على هذا الملف مباشرة من موقع الويب ، فإن ملف وحدات الماكرو متحد البؤر غير متاح بسهولة. لتوفير الوصول إلى هذا الملف ، تم إلحاق & quotConfocal Macros & quot بنهاية هذا الدليل. يجب نسخه إلى ملف & quotSimple Text & quot ، وحفظه كـ & quotConfocal Macros. & quot

5. البرامج الأخرى المستخدمة بالاقتران مع صورة المعاهد الوطنية للصحة

توفر NIH Image مجموعة متنوعة من العمليات القوية غير المتوفرة بسهولة في البرامج الأخرى ، بغض النظر عن السعر. ومع ذلك ، من الأفضل أداء بعض الوظائف باستخدام حزم البرامج الأخرى. ينطبق هذا بشكل خاص على تلك الإجراءات التي تستفيد من عمليات 24 بت الحقيقية ، مثل ضبط مستويات الألوان الفردية وترشيح الألوان وطباعة صور 24 بت لصبغ طابعات التسامي.

أ) Adobe Photoshop 3.0.5 و Canvas 5.0

تستخدم معظم مختبرات الفحص المجهري متحد البؤر حاليًا Adobe Photoshop 3.0 لضبط تشبع اللون والسطوع / التباين والقص وتجميع الرسوم التوضيحية المركبة لصور متعددة وتسمية الصور وطباعة صور RGB متحد البؤر. يوفر إصدار جديد من Canvas 5.0 (Deneba Corporation ، Miami ، FL) كل هذه الوظائف المهمة لبرنامج Adobe Photoshop التي يحتاجها علماء الميكروسكوب البؤري مقابل ثلث التكلفة تقريبًا. تتعامل Canvas 5.0 مع ملصقات النصوص والطبقات بشكل أفضل بكثير من Adobe Photoshop ، لكن أداة الاقتصاص تستغرق بعض الوقت لتعتاد عليها.

ب) FileMaker Pro 3.0

من أجل الاحتفاظ بسجل لمحتوى كل صورة أو سلسلة من الصور أثناء جمعها في النطاق البؤري ، قمت بإعداد قالب FileMaker Pro. يتم نشر النموذج أيضًا على خادم FTP لصورة المعاهد الوطنية للصحة ضمن & quotconfocals.hqx & quot. عند تنزيل وفك ضغط & quotconfocals.hqx & quot ، سيتم فك ضغط القالب كـ & quotConfocal_FileMaker_Template & quot. FileMaker Pro هو برنامج قاعدة بيانات بسيط وغير مكلف. وهي متاحة لكل من Macintosh و DOS / Windows ، والملفات قابلة للتبديل بين الإصدارين.

سيشجعك التصميم الدقيق لقاعدة البيانات على تخزين المعلومات المهمة بما في ذلك المواد والمعلمات المستخدمة لتجميع الصورة الأصلية وموقع تخزين الملف والتعديلات على الملف.

6. برامج قاعدة بيانات الصور

يمكن لبرنامج FileMaker Pro 3.0 حفظ الصور والنصوص. ومع ذلك ، ستقوم قواعد بيانات الصور المخصصة بمسح القرص تلقائيًا وإنشاء صور مصغرة ، وموقع التخزين ، ويمكنها إعادة فتح ملف الصورة الأصلي مباشرةً. قد يجد العديد من المستخدمين هذا أفضل. هناك العديد من قواعد بيانات الصور المفيدة ، بما في ذلك Multi-Ad Search 3.1 (خدمات الإعلانات المتعددة ، Peoria ، IL) ، Cumulus 2.5 ، Kudo و Kodak Shoebox (لم يعد Adobe Fetch متوفرًا). من بين قواعد البيانات المختلفة التي اختبرتها ، يعد Multi-Ad Search 3.1 و Cumulus 2.5 الأكثر فائدة. يعد Cumulus مفيدًا بشكل خاص لأنه يدعم Apple ScriptMaker ، ويمكنه تلقائيًا نقل الصور المصغرة إلى قاعدة بيانات FileMaker Pro. تمت جدولة إصدار مستخدم واحد منخفض التكلفة من Cumulus (3.0) في خريف عام 1996.

7. برامج الفهرسة: أين الملفات عندما تحتاجها؟

بحلول هذا الوقت ، ستكون مثقلًا بالملفات والأقراص المختلفة والأقراص المرنة و Zip و Jaz و magneto-Opticals و Syquests وكل شيء ما عدا الشريط الورقي. سيكون لديك إصدارات مختلفة من نفس الملف في العديد من المواقع المختلفة. كيف ستعثر على الملف الذي تحتاجه للنشر؟

توفر شركة Iomega Corp. (Roy، UT) أداة مساعدة تسمى & quotFindIt & quot مع محركات Jaz الخاصة بهم والتي تعمل على إنشاء دليل مجمع لمحتويات مختلف الأقراص الثابتة والمواد القابلة للإزالة. إنه يعمل جيدًا مع الأقراص الممغنطة الضوئية ومحركات الأقراص Zip و Jaz والأقراص المرنة. ومع ذلك ، فإنه سيعمل فقط مع محركات الأقراص التي لها تنسيق Macintosh. حتى أنه لا يتعرف على وجود قرص مضغوط مهيأ بجهاز الكمبيوتر أو قرص بصري مغناطيسي مهيأ بالكمبيوتر (انظر أدناه).

ثانيًا. تقييم الصور المتدفقة مع صورة المعاهد الوطنية للصحة قبل التصوير المتقارب

1. تقييم الصور الفلورية قبل الفحص المجهري متحد البؤر

أفضل طريقة للحصول على صور (كنفوكل) نهائية ممتازة هي البدء بعينة جيدة. كل السحر الرقمي في العالم لن يصنع صورة جيدة إذا بدأت بعينة سيئة.

سيوفر لك التقييم الدقيق للعينة ذات العلامات الفلورية الخاصة بك على مجهر فلوري عالي الجودة الكثير من الوقت والجهد على المجهر متحد البؤر. سيتم الحصول على أفضل صورك البؤرية من أقسام ذات جودة عالية. يتم التعرف على هذه الأقسام بسهولة على مجهر الفلورسنت القياسي. تشمل الصفات التي يجب تقييمها ما يلي:

أ) جودة الأنسجة العامة ، بما في ذلك التثبيت ، وقلة التمزق أو طي الأنسجة

ب) إشارة عالية لنسبة الضوضاء. يجب أن تكون العمليات المصنفة مشرقة ويمكن تمييزها بسهولة عن الخلفية. يطرح التألق في الخلفية العالية مشكلة صعبة لا يمكن التغلب عليها بسهولة حتى باستخدام أفضل مجهر متحد البؤر. سيطالبك ضعف الإشارة إلى نسبة التشويش بتعديل صورتك النهائية عن طريق زيادة التباين إلى الزيادة.

ج) فصل جيد للفلور. ستنتج الكثافة الساطعة للغاية من مضان إيزوثيوسيانات رباعي ميثيل رودامين (TRITC) أو إندوكاربوسيانين (Cy3) اختراقًا كبيرًا للصورة في نطاق صورة إيزوثيوسيانات الفلوريسين (FITC). بينما ستلاحظ عينك المجردة أن هذا اللون أحمر إلى حد ما ، فإن PMT في CLSM هي عمى ألوان وستكتشف ذلك ولن تميزه عن مكون FITC للصورة. بينما قد تساعدك عوامل التصفية الإضافية ، هناك العديد من الاستراتيجيات التي ستساعدك في التعامل مع هذه المشكلة.

    لا تستخدم TRITC مع FITC. جرب رودامين سلفونيل كلوريد (LRSC) أو إندوديكاربوسيانين (Cy5) بالتزامن مع ليزر أرجون كريبتون.

2. الانبعاث / الإثارة الفلورية: هدف متحرك

الإثارة / الانبعاث الفلوري هو عملية تدهور. كلما كانت الإثارة أكثر إشراقًا (ضمن الحدود) ، زادت سطوع الصورة المنبعثة الناتجة. لفحص الصورة من أجل التقييم المناسب لجودتها ومحتواها ، سيعرض المستخدم النسيج لفترات زمنية متزايدة. كل من سطوع الإثارة ومدة التعرض ، على الرغم من أنهما مطلوبان لتقييم الأنسجة ، يقللان أيضًا من جودة التألق. عند مستويات التشبع ، يبلغ عمر النصف لـ FITC و TRITC حوالي 1-2 ثانية فقط. عند التعامل مع العينات في الجسم الحي أو في المختبر ، تكون المشكلة أكثر وضوحًا ، حيث يؤدي التعرض المطول لضوء الإثارة الشديد إلى تدهور الخلايا ، ويسرع من موت الخلايا. (تم استخدام هذا لفائدة جيدة في القتل الانتقائي للخلايا المحددة في الأنسجة العصبية). تحقيق التكيف الجيد للظلام من قبل المراقب ، واستخدام المجاهر الفعالة ، والتبريد الفائق للعينة ، ونبض مصدر الضوء والعديد من الكواشف (غالبًا ما تكون سامة للخلايا الحية) تم استخدامها لتقليل التلاشي ، ولكن لا يمكن تجنب الفقد الحتمي للفلورة .

نتيجة لهذه القيود ، قد تجد أنك متردد في فحص الأنسجة مطولًا قبل الذهاب إلى المجهر متحد البؤر لالتقاط & quot؛ الكمال & quot الصور البؤرية الخاصة بك. ينتج عن هذا العديد من الصور البؤرية السيئة ، غالبًا نتيجة لحقيقة أن الأنسجة الأصلية لم يتم تقييمها بشكل صحيح قبل استخدام CLSM. لن تؤدي جميع الحيل في عالم المعالجة اللاحقة للصور البؤرية إلى تحسين العينة الرديئة. لن يأخذ CLSM الباهظ صورة جيدة لعينة سيئة.

في كثير من الأحيان ، سيكون من الأفضل للباحثين تعلم كيفية تحسين استخدامهم لمجهر الفلورسنت بشكل أكثر شمولاً قبل قضاء الوقت في اختراق الصور من مجهر متحد البؤر.

3. اختيار الفلوروفور

هذا موضوع كبير ومعقد. تم تناوله على نطاق واسع في الفصل الممتاز من قبل Brelje و Wessendorf و Sorenson (1993) في طرق الدراسة في بيولوجيا الخلية: التطبيقات البيولوجية الخلوية للفحص المجهري متحد البؤر ، تم تحريره بواسطة بريان ماتسوموتو.

إذا كنت تعمل مع فلوروفور واحد ، يبدو أن معظم المستخدمين يفضلون FITC أو Cy3. لطالما تم استخدام FITC ، ويتوافق الطول الموجي للانبعاث مع نطاق حساسية الذروة للعين البشرية. أصبحت Cy3 ، ذات الطول الموجي للانبعاث في النطاق الأحمر القصير ، شائعة بشكل متزايد. Cy3 متوهج بشكل مكثف وينزف على حد سواء مرتفع ومنخفض - استخدمه فقط في تكوين فلوروفور واحد ، ما لم تكن قد حددت مسبقًا أن المركبين المهمين لا يتشاركان في نفس البنية بالتأكيد. الميزة العظيمة للضوء الساطع للغاية هو أنه يمكنك استخدام فتحة أصغر ، مع إشارة مواتية إلى نسبة الضوضاء ، وطاقة ليزر أقل وأوقات تعريض أقصر.

ب) الفلوروفورات التسمية المزدوجة: FITC و LRSC أو FITC و Cy5

ج) الفلوروفورات ثلاثية التسمية: FITC و LRSC و Cy5

د) التسمية الرباعية: aminomethylcoumarin acetate (AMCA) و FITC و LRSC و Cy5 (يتطلب AMCA ليزرًا يثير في نطاق الأشعة فوق البنفسجية إلى اللون الأزرق القصير. في حين أن المجاهر ذات الليزر في هذا النطاق باهظة الثمن ، تتوفر بشكل متزايد.)

يمكن الحصول على كل هذه الفلوروفورات من مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية ، إنكوربوريتد (ويست جروف ، بنسلفانيا).

4. استخدام صورة المعاهد الوطنية للصحة لتصور Cy5

يواجه العديد من الأشخاص صعوبة في استخدام Cy5 للسبب الذي يجعله مفيدًا للغاية - يتم فصل انبعاثه على نطاق واسع عن انبعاثات FITC ، وبالتالي بالكاد يمكن رؤيته بالعين المجردة. يكون مرئيًا فقط إذا كنت معتادًا تمامًا ، ولديك مجهر فعال للغاية وشدة التألق قوية. حتى مع ذلك ، لن تتمكن من رؤية الكثير من التفاصيل الدقيقة.

ومع ذلك ، كمستخدمين لـ NIH Image ، لديك واحدة من أفضل الأدوات المتاحة لتصوير Cy5 ، إذا كان لديك كاميرا فيديو تدعم التكامل على الشريحة (انظر القسم التالي) وأداة التقاط إطار Scion LG-3. كاميرات الفيديو CCD حساسة جدًا في النطاق الأحمر إلى الأشعة تحت الحمراء. قدم Wayne Rasband ماكروًا مفيدًا يسمح لك بتغيير وقت التكامل على الشريحة وضبط مدة التكامل أثناء عرض الصورة على شاشة الكمبيوتر. لمزيد من التحكم في تلاشي الإشارة ، يجب أيضًا استخدام مصراع Uniblitz بين مصدر الضوء الفلوري والمجهر (انظر & quotMacros For Shutter Control & quot أدناه).

5. التكامل على رقاقة

كثافة الصور الفلورية منخفضة نسبيًا مقارنة بحساسية معظم كاميرات CCD. تأخذ كاميرات الفيديو عينة من الضوء المتاح ، ثم ترسل صورة كاملة إلى الشاشة كل 1/30 من الثانية (33.3 مللي ثانية أو 30 إطارًا في الثانية). في تلك اللحظة ، يتم مسح الصورة السابقة وتبدأ الكاميرا مرة أخرى في تجميع شحنة تتناسب مع شدة الضوء الساقط.

مع انخفاض كمية الضوء ، تنتج الكاميرا صورة مشوشة ومحببة أكثر. مع انخفاض مستويات الإضاءة بشكل تدريجي ، تفشل الكاميرا في اكتشاف عدد كافٍ من الفوتونات الساقطة لتوفير صورة مفيدة. لن يساعد متوسط ​​الإطارات ، ولن يساعد تكامل البرامج مع العديد من الصور الضعيفة.

في التصوير بالفيلم ، يتوفر للمستخدم عدد من الخيارات:

أ) زيادة سرعة الفيلم

ب) زيادة فتحة العدسة أو قدرة جمع الضوء للبصريات

ج) زيادة وقت التعرض - أي تقليل سرعة الغالق

الموقف المماثل يتعلق بتحسين التقاط الصور بكاميرات الفيديو.

أ) زيادة سرعة الفيلم

إذا كنت بحاجة إلى مراقبة الأحداث المتغيرة بسرعة ، فإن الإستراتيجية الوحيدة المتاحة لديك هي زيادة حساسية كاشفك باستخدام كاميرا فيديو مكثفة. هذا مكلف للغاية ، وغالبًا ما تتدهور جودة الصورة بواسطة المكثف.

ب) زيادة فتحة العدسة أو قدرة جمع الضوء للبصريات

كانت هناك تحسينات كبيرة في جودة الفلور ، ومصادر الضوء ، والعدسات والمرشحات. ومع ذلك ، لا تزال العديد من الصور باهتة جدًا بحيث لا يمكن التقاطها بشكل مناسب باستخدام كاميرا فيديو قياسية.

ج) زيادة وقت التعرض - أي تقليل سرعة الغالق

إذا كانت العينة الخاصة بك مستقرة ، فيمكنك اختيار أوقات تعرض أطول.

يعمل التكامل على الرقاقة عن طريق زيادة وقت التعرض ، وبالتالي زيادة عدد الفوتونات الملتقطة. بدلاً من إرسال الصورة إلى الشاشة كل 33 مللي ثانية ، يُسمح للفوتونات بالتراكم على المستشعر ، ويتم إرسال الصورة إلى الشاشة عندما تعتبر مشبعة بشكل كافٍ. كانت هذه التقنية متاحة لعقود عديدة ، ولكن غالبًا ما بدت التكلفة تتجاوز ميزانية معظم المعامل.

صورة المعاهد الوطنية للصحة ، جنبًا إلى جنب مع بعض الأجهزة الرخيصة ، تسمح الآن باستخدام هذه التقنية على نطاق واسع.

لكي يعمل هذا بشكل صحيح ، تحتاج إلى أربعة مكونات:

أ) كاميرا فيديو قادرة على التكامل على الرقاقة.

ب) مصدر لنبض TTL في توقيت مناسب.

ج) ملتقط إطار (محول رقمي للفيديو) يلتقط الصورة في اللحظة الصحيحة تمامًا التي ترسل فيها الكاميرا الصورة المدمجة.

د) جهاز كمبيوتر وبرنامج يمكنه التحكم في هذه العملية.

6. إرشادات عملية لتنفيذ التكامل على الشريحة

أ) اختيار الكاميرا: توفر العديد من كاميرات الفيديو الآن دوائر مدمجة للتكامل على الرقاقة دون أي تكلفة إضافية. وتشمل هذه أكثر كاميرات الفيديو استخدامًا في المختبرات ، وهما Cohu 4915 (Cohu Inc. ، San Diego ، CA) و Dage-MTI 72 (Dage-MTI ، Inc ، Michigan City ، IN). يُسمح للصور بالتراكم على مستشعر الكاميرا حتى يتم الوصول إلى مستوى مناسب من التعريض الضوئي. ثم يتم إرسال نبضة TTL إلى الكاميرا للإشارة إلى أن الكمبيوتر يتوقع الآن تلقي الصورة المتراكمة (المدمجة).

B) و C) مصدر نبضة TTL ومقبض الإطار المتزامن: جعلت بطاقة Scion LG-3 هذه التقنية متاحة بتكلفة منخفضة. في ظل ظروف التشغيل العادية ، يقوم LG-3 باستمرار باختبار المدخلات من كاميرا الفيديو وعرض النتائج على الشاشة. ومع ذلك ، في ظل التحكم المناسب في البرنامج ، توفر بطاقة LG-3 إخراجًا لنبض TTL الذي تتم مزامنته مع محول رقمي للفيديو ، ويلتقط الصورة التالية ويحتفظ بها في المخزن المؤقت للعرض.

د) يتم توفير برنامج التحكم في هذه العملية برمتها في صورة المعاهد الوطنية للصحة. قدم Wayne Rasband وحدة ماكرو للتحكم في مدة وقت التعرض للتكامل على الشريحة.

7. وحدات الماكرو للتحكم في المصراع

أوصي بشدة باستخدام مصراع Uniblitz بين مصدر ضوء الإثارة والعينة. تم تصنيع مصراع Uniblitz بواسطة Vincent Associates في مدينة روتشستر ، نيويورك. يمكن لمعظم مصنعي المجاهر توفير محول لتركيب الغالق بين مصدر الإثارة والمجهر. يتم التحكم في الغالق بواسطة صندوق تحكم Uniblitz متصل بالكمبيوتر.

تتمثل ميزة استخدام التحكم في الغالق في أنه سيحد من تعرض أنسجتك لتأثيرات التلاشي الناتجة عن الإثارة عن طريق قصر أوقات التعرض على تلك الفترة المطلوبة فقط لجمع الصور فعليًا. بدون ذلك ، غالبًا ما أنسى إغلاق الغالق يدويًا ، فقط لأكتشف أنني قد أحرقت أفضل عيناتي.

كتب Chi-Bin Chien ، الذي كان يعمل سابقًا في UCSD ، سلسلة من وحدات الماكرو للتحكم في الغالق. لقد قمت بدمج وحدات الماكرو للتحكم في الغالق مع ماكرو واين للتكامل على الشريحة. تتوفر وحدات الماكرو هذه كجزء من مجموعة & quotConfocal Macros & quot المتوفرة في موقع NIH Image FTP.

الوصف التالي يتعلق باستخدام عينة الفلورسنت. أقترح عليك التدرب على استخدام التكامل على الشريحة مع عينة ضوء مرسلة ، مع ضبط الإضاءة على مستوى منخفض للغاية. بمجرد أن تتقن إجراء التكامل على الشريحة ، يمكنك بعد ذلك تجربة عينة الفلورسنت.

أ) يجب تحديد نافذة الكاميرا. يمكن إغلاق المصراع. قم بإيقاف تشغيل AGC (التحكم التلقائي في الكسب) في CCU (وحدة التحكم في الكاميرا). اضبط الكسب اليدوي ومستوى اللون الأسود اليدوي تمامًا في عكس اتجاه عقارب الساعة.

ب) حدد الماكرو للتكامل على الشريحة. إذا لم يكن لديك مصراع Uniblitz ، فيجب عليك فتح المصراع اليدوي للسماح بإثارة العينة الخاصة بك.

ج) إذا كانت الصورة معتمة للغاية ، فحرك الماوس باتجاه الجزء العلوي من نافذة الكاميرا.

د) إذا كانت الصورة ساطعة للغاية ، فحرك الماوس باتجاه أسفل نافذة الكاميرا.

هـ) ستعرض نافذة المعلومات في الزاوية اليسرى السفلية من الشاشة تقريرًا عن عدد الإطارات التي تم دمجها مع أحدث صورة. يمكنك تعديل الماكرو لتوفير قراءة مباشرة لمدة التكامل بالثواني.

و) لاحظ الرسم البياني للحصول على أفضل انتشار لقيم السطوع.

ز) قد تجد أنه من المفيد إجراء تعديلات طفيفة في جودة الصورة عن طريق تغيير إعدادات الكسب ومستوى اللون الأسود في وحدة التحكم المركزية.

ح) عندما تكون راضيًا عن جودة الصورة ، قم بإنهاء جمع البيانات عن طريق تحريك الماوس بعيدًا عن الجانب الأيسر من نافذة الكاميرا واستمر في الضغط على زر الماوس. سيستمر عرض الصورة الأخيرة على الشاشة. سيتم إغلاق المصراع بعد ذلك ، مما يحمي العينة من مزيد من الإثارة الفلورية.

يتطلب هذا الإجراء ممارسة للحصول على صور ذات نطاق واسع من القيم.

مع زيادة وقت التكامل على الشريحة ، ستلاحظ تأخيراً ملحوظاً بين الوقت الذي تضغط فيه على زر الماوس وظهور التغيير في الصورة.

8. تكامل على رقاقة ، أقسام متعددة ذات علامات ، وصور RGB

تسمح لك صورة المعاهد الوطنية للصحة (NIH) بتقييم جودة المقاطع الملطخة المضاعفة قبل استخدام البؤر.

إذا حصلت أولاً على صور ذات جودة مثالية على نطاق الفلورسنت القياسي باستخدام صورة NIH ، فيمكنك حينئذٍ دمج الصور لإنتاج RGB Stack مفيد. يمكن تقييم ذلك مبدئيًا باستخدام وظيفة صورة المعاهد الوطنية للصحة RGB إلى اللون المفهرس . يمكن أيضًا حفظ Stack وإنتاج صورة RGB ذات جودة عالية 24 بت يمكن تعديلها بشكل أكبر في Adobe Photoshop.

أ) اجمع الصورة التي ترغب في أن تكون في الشريحة الحمراء من Stack ، باستخدام التكامل على الشريحة. اضبط الكسب ومستوى اللون الأسود للحصول على أوسع نطاق من القيم ، كما هو موضح في الرسم البياني للصورة.

ب) قم بتشغيل الماكرو المقدم & quotMake Stack من الصورة الحالية & quot. سيؤدي ذلك إلى أخذ الصورة المحددة الحالية ، وإنشاء مكدس جديد بثلاث شرائح ، للطائرات R و G و B ، ولصق الصورة المحددة في المستوى & quotred & quot.

ج) الآن قم بتجميع صورة ثانية باستخدام التكامل على الرقاقة. انسخه إلى المخزن المؤقت والصقه في الشريحة الثانية (& quotgreen & quot الطائرة).

د) إذا كان لديك قسم ذو ملصق ثلاثي ، فقم بتجميعه باستخدام روتين التكامل على الرقاقة ، وضعه في الشريحة الثالثة (& quotblue & quot الطائرة).

هـ) يمكنك الآن استخدام ملف RGB إلى اللون المفهرس العملية تحت الأكوام القائمة لتوليد صورة ملونة مفهرسة تظهر النتيجة المزدوجة أو الثلاثية.

F) يحفظ الملف كملف RGB TIFF. يمكن الآن فتحه باستخدام Adobe Photoshop للحصول على صور ملونة أفضل.

يمكن أتمتة الخطوات الواردة في الإجراء أعلاه بشكل تلقائي باستخدام وحدة ماكرو.

ثالثا. فتح الصور المتقاربة في صورة المعاهد الوطنية للصحة

يتم تصنيع CLSMs الأكثر استخدامًا بواسطة أدوات BioRAD و Zeiss و Leica. تخزن البرامج / الأجهزة المستخدمة لإنشاء الصور في هذه الأدوات الملفات بتنسيق ملف يستند إلى DOS. وبالتالي ، يواجه المستخدم مهمتين أوليتين: نقل الملف من جهاز كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل DOS إلى جهاز Macintosh وتحويل الملف من هيكل الملف الأصلي إلى ملف صورة NIH.

1. نقل الملفات من حاسوب قائم على DOS ، DOS / Windows أو OS / 2 إلى جهاز Macintosh

أقترح أن تقوم في البداية بجمع صورك على القرص الصلب المتصل بنظامك. سيؤدي ذلك إلى تسريع عملية جمع البيانات لسلسلة Z الممتدة. في نهاية كل جلسة عمل ، يمكنك نقل جميع الملفات إلى جهاز Macintosh الخاص بك باستخدام إحدى الطرق الثلاث: أ) Sneaker net ، أو B) شبكة المنطقة المحلية ، أو C) FTP عبر الإنترنت.

أ) حذاء نت

انقل الملفات من موقع التخزين على القرص الأصلي إلى Zip أو Jaz أو Syquest أو مغناطيسي بصري أو وسيط عالي السعة مماثل. يمكن تنسيق هذه الأقراص كقرص DOS ، ويتم نقل البيانات مباشرة من أجهزة كمبيوتر BioRAD و Zeiss و Leica CLSM إلى هذه الوسائط. يسمح لك برنامج Macintosh PC Exchange الذي يوفره Macintosh في نظام 7.1.2 والإصدارات الأحدث بقراءة الأقراص المرنة المهيأة بجهاز الكمبيوتر والأقراص المضغوطة وغيرها مباشرة. لا أوصي باستخدام محركات الأقراص المضغوطة لجمع البيانات الأصلية لأنها بطيئة نسبيًا ، مع أوقات وصول تصل إلى كاليفورنيا. 30 مللي ثانية. تتمتع محركات الأقراص Jaz و Syquest بأوقات وصول / كتابة تساوي تقريبًا أوقات الأقراص الثابتة. لمزيد من التعليقات والتحذيرات ، انظر أدناه.

يمكن حمل هذه الأقراص يدويًا إلى جهاز Macintosh الخاص بك ، والذي يُفترض أنه مزود بمحرك أقراص مشابه. يشار إلى هذا عادة باسم & quotSneaker net & quot. يتمثل القيد الرئيسي لهذه الطريقة في أنها تتطلب أن يكون جهاز Macintosh الخاص بك قادرًا على قراءة التنسيقات المختلفة للوسائط المختلفة. هذا ليس افتراضًا صالحًا دائمًا ويعتمد على قدرتك على العثور على برامج التشغيل الصحيحة لأنظمة التشغيل المختلفة لأنواع الوسائط المختلفة.

أفضّل أن يكون قرصًا ذا تكلفة معقولة يمكنه الاحتفاظ ببيانات يوم عمل نموذجي. محرك Zip ، بسعة تخزين كاليفورنيا. 100 ميجابايت وبسعر وحدة يبلغ حوالي 12-15 دولارًا ، على الرغم من بطئها نسبيًا ، يفي بهذين المعيارين.

لا أوصي باستخدام الأقراص المرنة. إنها بطيئة جدًا ومرهقة إذا كان لديك العديد من الملفات ، وتتطلب أن يكون لديك العديد من الأقراص المهيأة مسبقًا. إذا كان لديك سلسلة Z ممتدة على BioRAD CLSM ، فقد يكون حجم الملف 7-25 ميغابايت ، ولا يمكن نقله بسهولة عبر الأقراص المرنة.

تتمتع الأقراص الممغنطة الضوئية بسعة كبيرة وعمر طويل. ومع ذلك ، يبدو أن كل شركة مصنعة لمحرك الأقراص لديها مخطط تنسيق مختلف. أوصي بهم لأرشفة ملفاتك ، ولكن ليس لنقلها من CLSM إلى Macintosh. لقد عانينا من تفاقم لا نهاية له مع العديد من حالات عدم التوافق.

ب) شبكة المنطقة المحلية (LAN)

تتمثل إحدى الطرق الفعالة لنقل الملفات في الحصول على كل من الأجهزة المستندة إلى DOS و Macintosh على شبكة Ethernet مشتركة ، مع خادم محلي مشترك. إذا كان لديك مكتب لخدمات الكمبيوتر (أو شيء من هذا القبيل) ، فيمكنه توفير خيارات متنوعة للشبكة المحلية بين أجهزة Macintoshes وأجهزة الكمبيوتر. وسيلة بديلة هي استخدام MacLAN 5.5 لجهاز الكمبيوتر الخاص بك MacLAN (Miramar Systems، Inc.، Santa Barbara، CA) يعمل ضمن Windows 3.1 و Windows 95. يسمح MacLAN لـ Macintosh & quotChooser & quot برؤية الكمبيوتر كعميل آخر في منطقة AppleTalk ، و جهاز الكمبيوتر الخاص بك للعمل كما لو كان جهاز Macintosh آخر على شبكة AppleTalk الخاصة بك. بافتراض أنك معتاد على استخدام Macintosh على شبكة Ethernet ، فإن هذا يسمح بنقل الملفات البسيط بسرعة عالية. لقد وجدنا أن MacLAN فكرة جيدة ، ولكن يبدو أنه يعاني من أخطاء ومشاكل في الموثوقية وسرعة نقل الملفات.

ج) FTP عبر الإنترنت

يمكن إجراء النقل بين أجهزة الكمبيوتر التي لا تشترك في خادم أو شبكة مشتركة باستخدام بروتوكولات الإنترنت مثل FTP (بروتوكول نقل الملفات). من واقع خبرتنا ، فإن البرنامج الأكثر فعالية للقيام بذلك على Macintosh هو Fetch 2.1.2 (أو أعلى) ، وهو برنامج مجاني للمجال العام متاح على خادم zippy.nimh.nih.gov. سيسهل Fetch 2.1.2 جميع جوانب النقل من جهاز PC / DOS. إذا كنت لا تعرف كيفية إعداد جهاز الكمبيوتر الخاص بك كموقع FTP ، فاتصل بمركز الكمبيوتر المحلي للحصول على المساعدة. تتمثل ميزة FTP باستخدام Fetch 2.1.1 على Macintosh في أنه لا يبدو أنه يهتم بنوع نظام التشغيل الذي يعمل على المضيف البعيد.قد يكون برنامج Fetch أحد أكثر البرامج التي عملت معها مقاومة للقنابل - وهو مجاني!

عند إجراء FTP ، تأكد من إجراء النقل بتنسيق ثنائي ، وإلا ستكون الملفات غير قابلة للاستخدام.

لا تمسح الملفات الأصلية حتى تتأكد من حصولك على نقل وتحويل ناجحين. نوصي دائمًا بحفظ نسخ من الملفات الأصلية بتنسيقها الأصلي الأصلي (DOS أو OS / 2).

من العيوب المحتملة لكل من عمليات النقل عبر LAN و FTP أن الكمبيوتر المضيف الذي يحتوي على الملفات الأصلية يجب أن يكون متاحًا بشكل مستمر للنقل. إذا قرر شخص ما إيقاف تشغيل الكمبيوتر ، أو أراد استخدامه لجمع المزيد من البيانات قبل العودة إلى جهاز الكمبيوتر الخاص بك لإجراء عملية النقل ، فقد يتم قطع اتصالك. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كنت من مستخدمي Macintosh بشكل أساسي ، فقد تجد أن إعداد روابط LAN و FTP من جانب الكمبيوتر ليس بسيطًا كما هو الحال في Macintosh.

د) محركات الأقراص المضغوطة

تحتوي محركات Zip الجديدة من Iomega على وسائط قابلة للإزالة غير مكلفة تستوعب 100 ميغا بايت / قرص. عادة ما يكون هذا كافيًا لمجموعة CLSM ليوم واحد. الميزة الرئيسية لمحرك الأقراص Zip هي أنه متوافق أيضًا مع نظام التشغيل IBM OS / 2. لقد استخدمت هذا دون صعوبة مع إصدار Leica / Windows 3.1 و BioRAD Comos for DOS و LaserSharp 1024 الذي يعمل بنظام OS / 2 الخاص بشركة IBM. تتمثل ميزة محرك Iomega Zip في أن محرك الأقراص صغير الحجم وغير مكلف نسبيًا ويتم توفيره في نسختين مختلفتين من الأجهزة التي يمكن توصيلها إما بمنفذ SCSI القياسي على أجهزة Macintosh والعديد من أجهزة الكمبيوتر أو بالمنفذ المتوازي على أجهزة الكمبيوتر. يوفر Iomega برامج تشغيل للاستخدام مع أنظمة تشغيل MacOS و Windows 3.1 و Windows 95 و Windows NT و OS / 2 من IBM. تعد الأقراص ، إذا تمت تهيئتها للكمبيوتر الشخصي ، مناسبة أيضًا لنظام التشغيل OS / 2 ، ويمكن قراءتها على جهاز Macintosh باستخدام تبادل الكمبيوتر القياسي المتوفر في نظام تشغيل Macintosh.

    بضع كلمات تحذير حول استخدام الأقراص المضغوطة

إذا فتحت ملفًا على قرص مضغوط بتنسيق الكمبيوتر الشخصي على جهاز Macintosh ، فحينئذٍ يحفظ ستواجه صعوبة في استخدام القرص مرة أخرى على جهاز الكمبيوتر. لم يكن Iomega مفيدًا بشأن مسألة التوافق المتقاطع لبرامج التشغيل الخاصة بهم بين الكمبيوتر الشخصي و MacOS.

في ضوء المشكلات التي واجهتها مع محركات Zip المذكورة أعلاه ، فإن ممارستي الحالية هي نقل محتويات محرك Zip المهيأ بجهاز الكمبيوتر إلى محرك بصري مغناطيسي بتنسيق Macintosh. إذا كنت أرغب في استخدام الملفات الموجودة على جهاز Macintosh (على سبيل المثال ، في المنزل) ، فأنا أنقل الملفات إلى قرص مضغوط تمت تهيئته من أجل Macintosh.

لا يزال الاستقرار الأرشيفية لمحركات الأقراص المضغوطة غير معروف. أوصي بشدة بتخزين ملفات البيانات الأصلية على وسائط أرشيفية.

ه) الأقراص الممغنطة الضوئية لتخزين المحفوظات

إن أبسط وسيلة لتخزين كميات كبيرة من البيانات هي تخزين الملف على وسيط قرص قابل للإزالة بسعة كبيرة يمكن قراءته بواسطة أنظمة DOS و Macintosh و OS / 2. نظرًا لأن الصور البؤرية تولد ملفات بيانات كبيرة ، فإن معظم الأنظمة بها أقراص مغناطيسية ضوئية (MO) تتراوح من 500 ميجابايت إلى 1.3 جيجابايت. أحد الوسائط الشائعة لهذا هو قرص MO سعة 1.2 جيجابايت ، الذي تبيعه شركة Sony و Verbatim وغيرها. تتمتع هذه بميزة السعة الكبيرة ولها حياة أرشيفية لا تقل عن ثلاثين عامًا. محركات الأقراص الأكثر شيوعًا هي Tahiti Max Optix 3 و Pinnacle Sierra والعديد من وحدات Sony و Ricoh و HP و NEC. كثيرًا ما تكون الأقراص قابلة للتبديل (وإن لم يكن دائمًا). تم تزويد العديد من نطاقات BioRAD (كنفوكل) بمحركات Panasonic MO. تستخدم هذه الأقراص قرصًا خاصًا لا يمكن قراءته بواسطة محركات أقراص الشركات المصنعة المذكورة سابقًا. عند مواجهة محرك Panasonic ، استخدم LAN أو FTP لنقل ملفاتك.

حتى وقت قريب ، كانت هذه هي أكثر الوسائل شيوعًا لتخزين البيانات الأولية للفحص المجهري متحد البؤر. انخفض سعر الأقراص مؤخرًا ، وهي متوفرة الآن بحوالي 50 دولارًا للقرص 1.3 جيجا بايت. هذا هو حوالي نصف سعر محرك Jaz (أيضًا 1 جيجابايت) ، وعلى الرغم من أنه أبطأ من محركات Jaz ، إلا أنه أقل عرضة لفقدان البيانات.

تراجعت شعبية الأقراص الممغنطة الضوئية مؤخرًا بسبب التوافر الواسع والسعر المنخفض لمحركات الأقراص المضغوطة. واجه العديد من الأشخاص مشكلات عند محاولة قراءة الأقراص القياسية بسعة 1.2 جيجابايت والتي تم تنسيقها في الأصل على محرك أقراص Pinnacle أو Tahiti يستند إلى DOS. هذا أمر خطير بشكل خاص إذا كنت تستخدم OS / 2 مع LaserSharp 1024. هناك مشكلة كبيرة في الأقراص الضوئية الممغنطة وهي عدم وجود معايير عالمية للسائق. استخدم & quotMulti-Driver & quot على جهاز Macintosh لتسهيل قراءة الأقراص الضوئية بتنسيق DOS. & quotMulti-Driver & quot هي لوحة تحكم Macintosh مضمنة في حزمة البرامج المباعة بواسطة PC Access.

لا يمكن لبرنامج التشغيل البصري BioRAD OS / 2 قراءة الأقراص المغناطيسية الضوئية بتنسيق Macintosh في الوقت الحالي. لم أعد أوصي باستخدام الأقراص الممغنطة الضوئية لنقل الملفات من منصة الكمبيوتر الشخصي (Windows أو OS / 2) إلى Macintosh. اذهب مع شبكة Sneaker باستخدام محركات Zip أو LAN أو FTP. ومع ذلك ، تظل الأقراص الممغنطة الضوئية وسيلة مثالية لتخزين أرشفة الملفات الكبيرة.

2. فتح ملفات BioRAD في صورة المعاهد الوطنية للصحة

تتكون ملفات BioRAD من رأس 76 بايت يحدد حجم الصورة في العرض والارتفاع ، ويوضح ما إذا كانت سلسلة Z ، وبعد بيانات الصورة ، يوفر معلومات حول المعلمات أثناء جمع البيانات ومقياس التكبير والملاحظات . هيكل ملف البرنامج الجديد LaserSharp 1024 ، مشابه لهيكل الإصدارات السابقة من Comos ، مع استثناءات طفيفة فقط تتعلق بالتذييل في نهاية الملف الذي يحتوي على معلومات حول المعلمات المستخدمة أثناء جمع البيانات.

يمكن فتح ملفات BioRAD الفردية باستخدام امتداد يستورد وظيفة صورة المعاهد الوطنية للصحة. ومع ذلك ، يتطلب هذا أن يعرف المستخدم عرض وارتفاع الملف الفردي (غالبًا 768 × 512 في ملفات BioRAD من MRC600 512x512 أو 1024 × 1024 في LaserSharp 1024 لـ MRC1000 512x512 في ملفات Leica). لسوء الحظ ، لا يمكنني معرفة كيفية نقل صورة BioRAD مدمجة 8 بت إلى جهاز Macintosh. يبدو أن جدول البحث (LUT) المرتبط يتم تخزينه بطريقة أو موقع يراوغني. إذا قام شخص ما بحل هذه المشكلة ، فيرجى إبلاغي بذلك. ال يستورد وظيفة لا تسمح باستيراد سلسلة Z. سيقوم الماكرو الخاص باستيراد ملفات BioRAD باستيراد سلسلة Z بشكل صحيح.

تتيح الماكرو & quotImport BioRAD MRC Z Series & quot ، الواردة في الملف المرتبط & quotConfocal Macros & quot ، فتح أقسام فردية أو سلسلة Z. يعمل هذا بشكل جيد على الملفات التي تم إنشاؤها باستخدام Comos وتلك التي تم إنشاؤها باستخدام البرنامج الذي تم إصداره مؤخرًا ، LaserSharp 1024. يعمل LaserSharp 1024 تحت OS / 2. يمكن فتح هذه الملفات باستخدام نفس الماكرو المستخدم لفتح الملفات بتنسيق DOS. يقوم LaserSharp 1024 بتخزين كل مستوى ألوان منفصل لسلسلة RGB Z كملف منفصل. يمكن تخزين مستويات الصور الثلاث لملف RGB واحد بشكل اختياري كملف واحد.

بعد تحميل ماكرو BioRAD ، يمكنك & اقتباس & اقتباسه عن طريق تحديده من ملف مميز قائمة. سيطلب منك مربع الحوار & quotStarting Slice & quot في سلسلة Z-series. الافتراضي هو 1.00. اقبل هذه القيمة في الوقت الحالي. سيظهر ملف BioRAD يحتوي على صورة واحدة فقط على الشاشة بعنوان الملف الأصلي (على سبيل المثال ، Axons03.PIC). أقترح أن تقوم بذلك على الفور يحفظ الملف ، قبل إجراء أي تعديلات ، (على سبيل المثال ، & quotAxons03.PIC.Img & quot). سيتم تحميل هذا الماكرو أكبر عدد ممكن من الأقسام ، اعتمادًا على الذاكرة.

إذا تجاوز عدد الأقسام Z الذاكرة المخصصة للصورة NIH ، فسيتوقف الماكرو عن العمل. تستطيع يحفظ المجموعة الأولى من الأقسام في ملف منفصل. قريب الملف ، ثم قم بتشغيل الماكرو مرة أخرى & quotImport BioRAD MRC Z Series & quot ، ولكن عند المطالبة بـ & quotStarting Slice & quot ، أدخل رقم القسم Z الأخير المعروض. إذا كانت سلسلة Z الأصلية كبيرة جدًا ، فقد تضطر إلى القيام بذلك عدة مرات. يمكنك حل هذه المشكلة إما عن طريق شراء الكثير من ذاكرة الوصول العشوائي ، أو تخزين سلسلة Z بزيادات أقل. هذه المشكلة ملحوظة بشكل خاص إذا كنت قد جمعت صورًا بحجم 1024 × 1024 بالإضافة إلى جمع سلسلة Z الممتدة. (على سبيل المثال ، ينتج عن 70 قسمًا بحجم 1024 × 1024 ملفًا بحجم 74 ميجابايت تقريبًا.)

سيتم وضع المعايرة والملاحظات المرتبطة بملف صورة واحد في نافذة نصية منفصلة لصورة المعاهد الوطنية للصحة. إذا كنت ترغب في تضمين هذه المعلومات على الصورة التي قمت بحفظها كملف صورة للمعاهد الوطنية للصحة ، فيجب عليك ذلك معجون من نافذة النص إلى نافذة الصورة. إذا كانت ملاحظاتك تحتوي على معلومات حول حجم البكسل وأبعاد الصورة ، فاستخدم ذلك لمعايرة مقياس الصورة. (انظر & quotSet Scale & quot في دليل صور المعاهد الوطنية للصحة). بمجرد معايرة الصورة ، يحفظ الملف مرة أخرى. الإصدار الحالي من ماكرو BioRAD لا يقرأ بشكل صحيح ملف المعايرة أو الملاحظات المرفق بملف سلسلة Z.

يمكن تخزين BioRAD Z-series كملف واحد كبير ، أو كسلسلة من الأقسام الفردية. يتميز التكوين السابق بأنه يتم تخزين جميع الملفات ذات الصلة في مكان واحد. ومع ذلك ، فهذا يعني أيضًا أن هذه الملفات قد تكون ضخمة. باستخدام الماكرو أعلاه ، سيتم فتح سلسلة BioRAD Z في Stack جديد. احفظ هذا بالطريقة نفسها المقترحة أعلاه لملف صورة واحد.

إذا كانت هذه سلسلة Z ، فاستخدم الأكوام القائمة ، وحدد خيارات لإدخال حجم خطوة التركيز الآلي المستخدم عند تسجيل سلسلة Z في الأصل. يتم تخزين التكبير والتباعد بين الشرائح مع ملف BioRAD الأصلي.

قد تجد أنه من المفيد يضيف أ شريحة إلى بداية Stack لتسجيل تعليقات محددة حول السلسلة ، وما تمثله البيانات ، وصورة Z-projection لتوضيح محتويات الملف.

يحفظ ملفات BioRAD * .PIC الأصلية ، في حالة وجود ملفات. يمكنك نقل جميع الملفات الأصلية إلى دليل فرعي منفصل لتقليل الفوضى.

أ) BioRAD Split Screen Images

يمكن عرض مجموعة متزامنة من الأقسام ذات العلامات المزدوجة على BioRAD وحفظها على شاشة & quotsplit & quot الصورة ، مع عرض الصورتين من PMT 1 و 2 & quot جنبًا إلى جنب. & quot هذا له ميزتان:

    يمكنك مقارنة موقع المستضدات المختلفة مباشرة في وقت واحد

سيتم فتح الماكرو الموضح في القسم السابق وعرض صورة الشاشة المنقسمة. إذا كنت تريد فصل نصفي الشاشة إلى صور منفصلة ، فاستخدم الماكرو & quotMerge BioRAD Split & quot. سيؤدي هذا إلى تحويل الصورة المقسمة الأصلية إلى مكدس من ثلاث شرائح (الصورة اليسرى والصورة اليمنى وشريحة سوداء فارغة واحدة) ، ثم إنتاج صورة ملونة مدمجة. إذا كنت تريد تبديل المستويات الحمراء والخضراء ، فحدد النافذة التي تحتوي على مجموعة من ثلاث صور ، وقم بتشغيل الماكرو & quotSwap Red_Green & quot.

يمكن بعد ذلك حفظ المجموعة المكونة من ثلاث شرائح (يسار ويمين وفارغ) كصورة 24 بت بتنسيق Adobe Photoshop 3.0 ، بالطريقة التالية:

    إذا قمت بتشغيل الماكرو السابق ، وقمت بإنشاء صورة RGB في صورة NIH ، فستقوم NIH Image بحفظ الملف كملف RGB-TIFF. هذا التنسيق مقبول كصورة Adobe Photoshop 3.0 RGB.

ب) دمج تقسيم الشاشة سلسلة Z

الماكرو الذي يعمل على سلسلة Z لقسم متعدد العلامات متعدد الشاشات مقسم إلى:

    ضع الصورة اليسرى في حزمة واحدة ، والصورة اليمنى في حزمة ثانية.

تنسيق ملف Leica هو تنسيق TIFF. نظام التشغيل Leica هو نظام هجين غريب يستخدم ناقل VME مع وحدة معالجة مركزية 68040 تعمل تحت OS / 9 ، ولكنه يستخدم واجهة Windows الأمامية التي تولد أنواع ملفات DOS. أعلنت شركة Leica عن إطلاق برنامج / نظام تشغيل جديد لمجهرها المتحد البؤر ، استنادًا إلى Windows NT. تنسيق الصور ، ومع ذلك ، لن يتغير كما ورد. يمكن قراءة ملفات Leica الأصلية (وملفات Windows NT الجديدة) مباشرة بواسطة Macintosh. ستظهر على سطح مكتب Macintosh كملفات كمبيوتر ، مع رموز اختيارية متنوعة ، اعتمادًا على كيفية تعيين معلمات النظام في لوحة التحكم ، تبادل الكمبيوتر الشخصي. كل ملف صورة منفصل مصحوب بملف & quotinfo.dat & quot. يتم تخزين سلسلة Z كملفات مفردة بأرقام متسلسلة ولكن مع ملف info.dat واحد فقط للسلسلة بأكملها. لتقليل الالتباس في التعامل مع هذه السلسلة Z مع عدد كبير من الملفات ، انقل كل مجموعة Z-series إلى مجلد منفصل على جهاز Macintosh الخاص بك.

إذا كنت تقوم بتشغيل NIH Image ، فيمكنك ذلك افتح هذه الملفات مباشرة ، دون الحاجة إلى ذلك يستورد معهم. ومع ذلك ، لن تتمكن من النقر نقرًا مزدوجًا فوق الملفات لفتحها في صورة المعاهد الوطنية للصحة. للقيام بذلك ، اتبع الإجراء التالي:

أ) الحصول على نسخة من & quotCTC 1.4 & quot (أو أحدث) لتغيير نوع الملف ومنشئه. يتوفر CTC 1.4 من خادم صور NIH على zippy.nimh.nih.gov.

ب) حدد جميع ملفات رسومات Leica في كل مجلد (وليس ملفات information.dat) واسحبها أعلى أيقونة CTC.

ج) باستخدام مربع الحوار الناتج ، قم بتغيير & quotNew Creator & quot إلى تخيل ، والعلامة & quotNew Type & quot to شجار (المنشئ والنوع حساسان لحالة الأحرف ، لذا أدخل بالضبط كما هو هجائي).

ستحتوي جميع الملفات الآن على رمز صورة NIH ، وسيتم التعامل معها كملفات صورة NIH بواسطة البرنامج.

يجب تغيير ملفات info.dat إلى & quotN New Creator & quot تخيل و & quot؛ نوع جديد & quot إلى نص . يحتوي هذا الملف على معلومات مهمة بما في ذلك عوامل القياس وحجم الصورة وحجم البكسل والتباعد في سلسلة Z.

لفتح حزمة Leica Z-series Stack:

أ) قريب جميع نوافذ صور المعاهد الوطنية للصحة الأخرى في هذا الوقت. تأكد من وضع جميع ملفات صور Leica ذات الصلة في مجلد منفصل.

ب) حدد افتح من ملف قائمة. في مربع الحوار الناتج ، انتقل إلى المجلد المطلوب وانقر فوق & quotOpen All & quot ، ثم افتح . سيؤدي هذا إلى فتح جميع الملفات بتسلسل سريع.

ج) حدد ويندوز لتكديس من الأكوام قائمة. تأكد من ضبط مقاييس التكبير / المعايرة وتباعد الشرائح.

د) يحفظ المكدس الناتج باسم جديد.

4. ملفات زايس

ملفات Zeiss التي تم حفظها باستخدام الإصدار الأحدث من البرنامج مع LSM 310 و 410 هي ملفات & quot قياسية & quot * .TIF. استخدم نفس الإجراء الموضح أعلاه لملفات Leica - على سبيل المثال ، استخدم CTC لتغيير & quot منشئ جديد & quot إلى تخيل و & quot؛ نوع جديد & quot إلى شجار . يمكن بعد ذلك فتح الملفات مباشرة بواسطة NIH Image. تأكد من ضبط جدول البحث بشكل صحيح. لقد وجدت غالبًا أن خريطة Zeiss LUT مقلوبة ، بمنحدر سلبي وصورة مقلوبة. انقر فوق الرمز الموجود في الزاوية اليسرى السفلية من نافذة التعيين للحصول على العلاقة الصحيحة بين الأسود والأبيض.

5. الديناميات الجزيئية / ساراسترو

قدم جاي هيرش معلومات عن تنسيق ملفات Molecular Dynamics. ملفات البيانات هي ملفات بسيطة بدون رأس أو تذييل. يتم تخزين كل صورة من سلسلة Z كملف منفصل. يتم تخزين المعلومات حول صورة واحدة ، أو حول سلسلة Z في ملف نصي منفصل. يمكن فتح الملف النصي مباشرة بواسطة صورة NIH.

أ) ضع جميع الصور المرتبطة لسلسلة Z واحدة في مجلد واحد. تأكد من ترقيمها بشكل صحيح لتعكس ترتيب المجموعة (على سبيل المثال ، 008.ext ، 009.ext ، 010.ext ، وليس 8 ، 9 ، 10).

ب) حدد يستورد من عند الأكوام قائمة. يجب أن يعرف المستخدم تنسيق الصورة (512 × 512 أو 1024 × 1024) لاستخدامها بشكل صحيح. قيمة الإزاحة هي 0.

ج) تحديد المربعات & quotOpen All & quot و & quotInvert & quot.

د) انقر افتح . سيؤدي هذا إلى فتح جميع الملفات على الشاشة.

ه) حدد ويندوز لتكديس من كومة قائمة.

F) يحفظ المكدس باسم من اختيارك.

6. ملفات نوران متحد البؤر

هناك نسخة من صورة المعاهد الوطنية للصحة التي تستخدم لجمع البيانات مباشرة على نوران. من الواضح أن الملفات الناتجة متوافقة مع صورة المعاهد الوطنية للصحة. يُباع Noran أيضًا بإصدار Image-1 ، وهو برنامج قائم على DOS. يتوفر الآن إصدار من هذا البرنامج لنظام التشغيل DOS / Windows. ليس لدي معلومات حول تنسيق الملف المستخدم بواسطة Image-1.

رابعا. التلاعب الأساسي بالصور

توفر NIH Image للمستخدم مجموعة واسعة من أدوات معالجة الصور. يجب أن تكون على دراية كاملة بجميع هذه الأدوات ، بما في ذلك كيفية الحصول على مدرج تكراري ، وكيفية تفسير المدرج التكراري ، والتلاعب في جدول البحث (LUT) ، واستبدال LUT بالمقياس الرمادي القياسي ، وعكس جدول البحث (LUT).

ضع في اعتبارك أن معظم التغييرات ستتم فقط على المخزن المؤقت & quotdisplay & quot وليس على & quotfile & quot المخزن المؤقت. وبالتالي ، إذا قمت بفحص مدرج تكراري ، ثم قمت بتعديل السطوع و / أو التباين ، فلن يتغير الرسم البياني. إذا كنت الآن تطبيق طرفية إلى المخزن المؤقت للملف ، سيعكس الرسم البياني الجديد هذه التغييرات. لن يتم تغيير الملف الأصلي ، المخزن على القرص الخاص بك ، من خلال هذه العملية إلا إذا قمت بذلك الآن يحفظ هذا الملف المعدل. يجب على القارئ استخدام أحد نماذج ملفات CLSM الخاصة به للتعرف على عمليات صورة المعاهد الوطنية للصحة. يتم التعامل مع جميع العمليات في هذا القسم بالكامل في دليل صور المعاهد الوطنية للصحة ، حول صورة المعاهد الوطنية للصحة.

يمكنك الآن فتح أحد الملفات التي قمت باستيرادها إلى Macintosh. حتى تصبح خبيرًا في البرنامج ، قم بعمل نسخة احتياطية من الملف ، واعمل فقط على النسخة ، وليس الملف الأصلي. باستخدام حفظ باسم. وظيفة NIH Image ، قم بتغيير اسم الملف بحيث لا تقوم بتعديل ملف البيانات الأصلي الخاص بك عن طريق الخطأ.

1. تقييم جودة صورة CLSM الأصلية الخاصة بك

كما ذكرنا سابقًا ، ستعتمد جودة الصورة التي تحصل عليها من المعالجات التالية بشكل مباشر على جودة الصورة التي تبدأ بها. وبالتالي ، إذا بدأت بصورة رديئة ، فقد تتمكن من جعلها تبدو جيدة المظهر ، لكنها ستظل صورة رديئة.

أ) التأكد من أن صورة CLSM الأصلية تستخدم النطاق الكامل لقيم 8 بت (0-255)

الخلل الأكثر شيوعًا في الصور البؤرية ، كما هو الحال مع صور الفيديو بشكل عام ، هو أن المستخدم لم يستخدم النطاق الكامل 8 بت للقيم الرمادية. قد تجعل العديد من عمليات التلاعب التي تقوم بها على CLSM الأصلي صورتك تبدو مرضية. ومع ذلك ، لا تحتوي العديد من ملفات البيانات على نطاق ديناميكي كامل من القيم (0-255) ، وتم تدليك الصورة عن طريق نشر نطاق ضيق من القيم بشكل مصطنع (على سبيل المثال ، 50-120) عن طريق تعديل جدول البحث.

من أجل تطوير تقدير لمحتوى المقياس الرمادي لصورك في صورة المعاهد الوطنية للصحة ، قم بفحص الرسم البياني للصورة.

    تأكد من أن نافذة الصورة نشطة عن طريق النقر فوق أي مكان داخل النافذة.

تعلم كيفية استخدام التعديلات على مستوى اللون الأسود واكتساب CLSM لتحسين انتشار القيم الرمادية. إذا كان عليك المفاضلة بين استخدام الموضع & quot + 1 إلى +3 LUT & quot على BioRAD مقابل إعداد أكثر إشراقًا لليزر ، فاختر إعداد الليزر الأكثر إشراقًا. ستحرق عينتك بشكل أسرع ، لكنها تمنحك إشارة أفضل إلى نسبة الضوضاء ونطاق ديناميكي أوسع بقيمة مقياس رمادية. غالبًا ما يوفر وضع & quot عد الفوتون & quot ، أو الوضع & quotAccumulate & quot في BioRAD صورة بأفضل نطاق ديناميكي.في BioRAD ، أفضل استخدام الوضع & quotAccumulate & quot مع & quotSlow Scan & quot للحصول على أفضل النتائج. ليس الغرض من هذا الدليل تعليم استخدام CLSM ، لكني أود فقط التأكيد على أهمية جودة الصورة الأصلية.

ب) تجنب الصور عالية التباين

إذا كنت معتادًا على التحقق من الرسم البياني لصورك أثناء جمعها على CLSM ، فسوف تقوم بتحسين جودة الصور الأصلية ، وستجد حاجة أقل للتلاعب بقيم طرفية المستعملين (LUT).

ج) تجنب الصور الصاخبة

إذا أمكن ، اجمع الصور باستخدام الإعداد & quotF1 & quot (Slow) (على BioRAD) مع إعداد Kalman على الأقل 3 ، أو & quotAccumulate & quot الوضع. عند استخدام & quotAccumulate mode & quot ، يمكنك استخدام مصدر ليزر أقل كثافة ، والتراكم يدويًا حتى تبدو الصورة مرضية.

2. تحرير الصورة

أ) اقتصاص الصور ، ومسحها ، وتركيب النص ، وقياس الأشرطة ، وتدوير وتحجيم الصور

يوفر NIH Image مجموعة واسعة من الأدوات لتحرير صورتك. هذه موصوفة في دليل صور المعاهد الوطنية للصحة حول صورة المعاهد الوطنية للصحة.

    ملاحظات حول القياس

    الحذر بشأن مقياس وتدوير الصور

3. استخدام طرفية المستعملين

تُستخدم العمليات التالية بشكل شائع لتحسين الصورة. هذه عمليات قياسية على جميع النطاقات (كنفوكل) ، وتستند إلى الأساليب المستخدمة على نطاق واسع لمعالجة الصور الرقمية. انظر القسم المناسب من دليل صور المعاهد الوطنية للصحة.

أ) تعديل السطوع والتباين

في أبسط عملية تتضمن جداول بحث ، يمكنك اختيار التأكيد على نطاق محدد من قيم الفهرس (قيم التدرج الرمادي) وتقليل القيم الأخرى. قد يعتمد الاختيار على تفسيرك لمحتوى معلومات الصورة. يعد تعلم كيفية تفسير الرسم البياني وتعديل السطوع والتباين من المهارات الأساسية في معالجة الصور.

ب) جداول البحث الخطية وغير الخطية ، بما في ذلك جداول البحث المخصصة

جدول البحث القياسي المعروض في نافذة التعيين (الجانب الأيسر السفلي من الشاشة) هو جدول البحث الخطي. يمكنك تعديل قيم السطوع والتباين إما بسحب ملف السطوع والتباين شريط التمرير ، أو عن طريق سحب الخط المرسوم مباشرة في نافذة التعيين.

يوفر ملف & quotConfocal Macros & quot المضمن في هذا الدليل عددًا من جداول البحث غير الخطية البديلة استنادًا إلى أخذ عينات من القيم الموجودة في المخزن المؤقت للعرض. وتشمل هذه التحويلات Log و Parabolic و Square و Square Root و Gamma. العب مع كل من هؤلاء ولاحظ التأثيرات على صورك. من المحتمل أن تجد تحويلات جاما مفيدة للغاية عند استخدامها مع إعداد من 1.5 إلى 2.0. ينتج عن العديد من التغييرات الناتجة نتائج مشابهة لتلك التي تم الحصول عليها على BioRAD بإعدادات +1 و +2 و +3. عند فتح ملفات BioRAD باستخدام NIH Image ، قد لا تتطابق النتائج مع ما رأيته في BioRAD. الأكثر شيوعًا ، ستظهر الصورة أكثر قتامة ، وتفتقر إلى التفاصيل التي تتذكر بوضوح رؤيتها على الشاشة عند جمع الصورة الأصلية. NIH Image لم تتلف ملفاتك. يرجع هذا في أغلب الأحيان إلى حقيقة أن الصورة التي شاهدتها على المجهر متحد البؤر قد يكون لها إخراج غير خطي LUT مرفق بها. يتم استيراد البيانات الأصلية سليمة ، ولكن إخراج LUT غير مرفق بملف صورة NIH الجديد ، ويتم إلحاق جدول بحث LUT خطي جديد بالملف. راجع دليل صور المعاهد الوطنية للصحة للحصول على إرشادات حول كيفية تعديل جدول البحث.

ج) تحسين عامل التباين في صورة المعاهد الوطنية للصحة

ال تحسين عنصر القائمة في صورة المعاهد الوطنية للصحة لديه وظيفة محددة بعنوان تعزيز التباين. ينتج عن هذا تأثير LUT الخطي المخصص الذي يكون جيدًا مثل أي نتيجة يمكنني الحصول عليها في محاولاتي لتعديل منحنيات جدول البحث اليدوي. ومع ذلك ، قد تجد أن هذه العملية تنتج صورة متباينة بشكل مفرط ، مع وجود منحدر شديد الانحدار في نافذة تعيين جدول البحث المحلي. إذا كان الأمر كذلك ، فقم بتغيير جدول البحث يدويًا في نافذة التعيين لإعطاء ميل لجداول البحث في منتصف المسافة تقريبًا بين القيمة الأصلية والقيمة التي تنتجها تعزيز التباين . إذا كان هذا مرضيا ، إذن تطبيق طرفية (القيادة + L. ). إذا كنت تشعر أنك تريد المزيد من التباين في الصورة ، فكرر التسلسل أعلاه.

لتقدير تأثيرات هذه العملية على الصورة الأصلية ، قم بفحص الرسم البياني للصورة قبل وبعد هذا الإجراء.

كما هو الحال في جميع التعديلات على طرفية المستعمرات (LUT) ، فإن ملف تعزيز التباين تعمل العملية على تعديل المخزن المؤقت للعرض فقط ، وليس الصورة الموجودة في المخزن المؤقت للملف أو الملف الأصلي الموجود على القرص. من أجل تغيير المخزن المؤقت للملف ، يجب عليك تنفيذ تطبيق طرفية . هذا لن يغير ملف القرص الأصلي الخاص بك. إذا كنت ترغب في القيام بذلك ، يحفظ الملف. بمجرد القيام بذلك ، لا يمكنك العودة إلى الصورة السابقة. لذلك ، قد تفضل حفظ الملف المعدل باسم بديل.

تعزيز التباين يختلف كثيرًا عن تعادل العملية ، والتي من المحتمل أن تؤدي إلى صور شديدة البقعة. قارن بين تأثير كل من هذه العمليات على مظهر الخرائط ونوافذ الرسم البياني وطرف البحث.

د) تقطيع العتبة والكثافة

انظر دليل صور المعاهد الوطنية للصحة.

ه) صور Pseudocoloring

تساعد الصور البؤرية الزائفة المشاهد في عرض المقاطع المزدوجة المسمى ، واكتشاف الاختلافات الرئيسية في التركيز ، أو تغيير التركيزات ، كما هو الحال في تصوير نسبة الكالسيوم. راجع عنصر القائمة المناسب ودليل صور المعاهد الوطنية للصحة لاستخدام هذه العملية. جميع تطبيقات الألوان الموضحة في هذا الدليل ، على الرغم من أنها قد تشبه صورة الفلورسنت الملونة الأصلية ، إلا أنها ألوان زائفة.

و) التصدير إلى أدوبي فوتوشوب

تقوم الإصدارات الحديثة من NIH Image بحفظ الملفات الفردية وملفات RGB بتنسيق يمكن فتحه مباشرة بواسطة Adobe Photoshop 3.0. هذا لن يعمل مع سلسلة Z.

4. تحسين / تصفية الصورة

توفر NIH Image مجموعة كبيرة من الأدوات لتحسين الصور وتصفيتها ، بما في ذلك المرشحات لتوضيح الحواف وتنعيمها وتظليلها واكتشافها. يمكنك كتابة النواة الخاصة بك وتشغيل المرشحات المتوسطة وعوامل Sobel. بعض هذه العمليات عبارة عن عمليات متعددة المراحل وتغيير كل من المخزن المؤقت للعرض ومخزن الملف المؤقت (ولكن ليس ملف القرص) ، ولا يمكن أن يكون تم التراجع عنه . سيتعين عليك إعادة فتح الملف الأصلي لاستعادة الصورة.

لمزيد من التفاصيل ، انظر دليل صور المعاهد الوطنية للصحة.

5. القياسات الكمية

تم تطوير صورة المعاهد الوطنية للصحة في الأصل للقياسات الكمية. هناك العديد من الوظائف المفيدة الموضحة في دليل About NIH Image. تشمل وظائف القياس المختلفة: الطول والمساحة والكثافة وعد الجسيمات وملف تعريف الخط. حول NIH Image ستوفر إرشادات حول استخدام هذه العمليات.

6. NIH Image Macro Language

واحدة من أقوى ميزات NIH Image هي لغة الماكرو. هذا يسمح للمستخدم بكتابة نصوص بسيطة تشبه باسكال. تحتوي مجموعة أدوات التوزيع المتوفرة من موقع FTP على العديد من نماذج وحدات الماكرو التي يمكن تعديلها بسهولة وفقًا لاحتياجاتك الخاصة.

خامسا - موضوعات متقدمة

1. دمج أزواج من الأقسام ذات العلامات المزدوجة

واحدة من أكثر ميزات الفحص المجهري متحد البؤر قيمة والأكثر استخدامًا هي سهولة الحصول على صور لأقسام نسيجية مزدوجة وثلاثية المسمى. هناك نوعان من العوائق الرئيسية التي قد تسبب صعوبات عند محاولة دمج صورتين:

أ) قد تختلف قيم التباين والسطوع في أحد الأقسام بشكل ملحوظ عن القسم (الأقسام) الآخر. وأفضل طريقة للتعامل مع هذا الأمر هي التقييم الدقيق للصور في وقت جمع البيانات الأصلية وتعديل وسائل جمعها.

ب) قد لا يتم تسجيل سلسلتي الصور من هذا الزوج بشكل مثالي مع بعضهما البعض. قد يكون هذا بسبب عوامل مختلفة ، بما في ذلك عدم محاذاة فرق PMT والمرايا وكتل المرشح. يبدو أن معظم الأخطاء تحدث في الترجمة (المحور X و Y) وليس في الدوران. قد لا يتم ملاحظة إزاحة بضع وحدات بكسل ، ولكن يؤدي الخطأ أحيانًا إلى حدوث تحول ملحوظ من مستوى لون إلى المستوى الثاني. يمكن تصحيح أخطاء الترجمة البسيطة عن طريق إزاحة الصور بمقدار بكسل واحد أو أكثر في المرة الواحدة. يصعب تصحيح أخطاء الدوران ، وتستغرق وقتًا أطول ، وتؤدي في كثير من الأحيان إلى التواء الصورة. إذا وجدت أنك قد حددت أخطاء دورانية ، فيجب على موظفي الخدمة من الشركة المصنعة للميكروسكوب البؤري التعامل مع هذا الأمر.

توفر صورة المعاهد الوطنية للصحة عملية محاذاة & quotRegister & quot. يمكن استخدام هذا على أقسام في Stack (انظر أدناه).

أ) صورة المعاهد الوطنية للصحة وأدوبي فوتوشوب

يمكن دمج صورتين أو ثلاث صور ذات مقياس رمادي لفلوروفورات مختلفة في صورة ملونة واحدة ، مع تمثيل كل فلوروفور بلون مختلف. اللون الذي تم اختياره لتمثيل كل فلوروفور هو تعسفي ، ويمكن أن يختلف عن اللون الأصلي. هناك نوعان من البرامج المختلفة التي يمكن استخدامها بنجاح لهذا الغرض ، NIH Image و Adobe Photoshop. هناك مزايا وعيوب في استخدام كل برنامج. Adobe Photoshop مكلف نسبيًا ، لكنه برنامج تجاري رائع. وهو يدعم الصور ذات 24 بت ويسمح بضبط فوري تقريبًا لمستويات الأحمر والأخضر والأزرق الفردية للصورة المدمجة. تنتج NIH Image لوحة مخصصة 8 بت للصورة المدمجة. يستغرق إنتاج هذه الصورة على Macintosh IIfx من 5 إلى 10 ثوانٍ ، وتكون في المقابل أسرع على Quadra 950 أو PowerPC. على الرغم من أن هذه صورة ملونة 8 بت ، إلا أن النتيجة غالبًا ما تكون مرضية ، وفي بعض الأحيان يمكن مقارنتها بتلك التي يمكن الحصول عليها باستخدام Adobe Photoshop. ومع ذلك ، قد تنتج صورة المعاهد الوطنية للصحة ثباتًا زائدًا للصورة الناتجة ، ولا يمكنك إجراء تعديلات صغيرة في السطوع أو التباين للصورة الملونة النهائية التي تم الحصول عليها باستخدام صورة المعاهد الوطنية للصحة. بدلاً من ذلك ، يجب عليك الرجوع إلى الصور ذات المقياس الرمادي الأصلي وتعديلها ثم مرة أخرى دمج الصور.

نظرًا لأن كل & quotIndexed Color & quot صورة تم إنتاجها باستخدام NIH Image لها جدول البحث الفريد الخاص بها ، لا يمكنك إجراء مقارنة مباشرة جنبًا إلى جنب لصورتين مختلفتين بالألوان إذا قمت بدمج & quotCustom Colors & quot ، حيث تتغير قيم اللون بشكل ملحوظ أثناء تغيير النوافذ. إذا قمت بتحديد & quotSystem Colors & quot ، فستكون جودة اللون محدودة بشكل أكبر ، ولكن ستتمكن من مقارنة النتائج مع النوافذ الأخرى المدمجة باستخدام نفس نظام LUT. هذا عيب رئيسي في الاعتماد حصريًا على صورة المعاهد الوطنية للصحة. ومع ذلك ، بالنسبة للعمليات الروتينية ، فإن صورة المعاهد الوطنية للصحة مرضية.

بالمقارنة ، يتيح لك Adobe Photoshop ، الذي يستخدم نافذة كاملة 24 بت ، مقارنة عدة صور ملونة في وقت واحد على شاشة واحدة. يوفر Adobe Photoshop أيضًا مجموعة ممتازة من المرشحات والتلافيفات. تتجلى المزايا الأكثر إلحاحًا لصورة المعاهد الوطنية للصحة في قدرة القياس ، وتوليد الأكوام ، وإسقاطات السلسلة Z ، والإسقاطات والدورات ثلاثية الأبعاد. لا يوفر Adobe Photoshop مثل هذه التسهيلات.

حتى وقت قريب (قبل الإصدار 1.56) ، لا يمكن تشغيل صورة NIH إلا في ظل إعداد شاشة 8 بت. إذا أردت الانتقال ذهابًا وإيابًا من NIH Image إلى Adobe Photoshop ، فسيتعين عليك إعادة ضبط الشاشة إلى 24 بت. بدءًا من الإصدار 1.56 ، تعمل NIH Image بشكل مرضٍ مع ضبط الشاشة على 24 بت.

يتيح الإصدار 1.59 من NIH Image الآن للمستخدم حفظ حزمة RGB من ثلاثة أقسام بتنسيق يمكن قراءته مباشرةً بواسطة Adobe Photoshop 3.0. إذا تم تعديل الملف في Adobe Photoshop ، ثم حفظه كملف Adobe Photoshop TIFF ، فيمكن إعادة فتحه بواسطة NIH Image كمكدس ثلاثي الشرائح. ومع ذلك ، إذا قمت بإضافة المزيد طبقات أو القنوات في Adobe Photoshop ، يجبرك على ذلك يحفظ الملف بتنسيق Adobe Photoshop. لا يمكن قراءة هذا بواسطة صورة المعاهد الوطنية للصحة. تحتوي سلسلة Z على صورة NIH مندمجة شرائح الألوان لا يمكن قراءتها بواسطة Adobe Photoshop.

ب) الأقسام ذات العلامات المزدوجة: بناء مكدس (من الأفضل القيام به باستخدام ماكرو)

    دمج الألوان في صورة المعاهد الوطنية للصحة

لوحتان من الألوان: إذا كنت ترغب في دمج لوحين فقط ، فافتح الملفين.

استخدم الماكرو & quotColor Merge Two Images & quot المضمنة في العينة & quotConfocal Macros & quot المتوفرة مع هذا الدليل. إذا قمت بفحص تسلسل الأوامر في الماكرو ، فستجد العمليات التالية:

أ) افتح كومة جديدة

ب) معجون & quoted & quot الصورة في الشريحة الأولى

ج) يضيف شريحة لإضافة شريحة إضافية

د) معجون & quotgreen & quot الصورة في الشريحة الثانية

ه) يضيف شريحة لإضافة شريحة ثالثة سوداء (فارغة)

F) دمج من RGB إلى لون 8 بت باستخدام جدول البحث المخصص

ز) افتح نافذة جديدة تحتوي على الصورة الملونة المدمجة

بالتناوب ، يمكنك القيام بهذه العملية يدويًا للتعرف على الإجراء. سيصبح الملف الأول الذي يتم فتحه هو المستوى الأحمر ، والملف الثاني هو المستوى الأخضر. تحت بند القائمة كومة يختار ويندوز لتكديس . سيؤدي هذا إلى وضع اللوحين في مكدس بعنوان & quotRGB & quot. لن تؤدي أي عمليات أخرى إلى تغيير ملفات البيانات الأصلية ، لذا يمكنك دائمًا العودة والبدء من جديد.

يحفظ نسخة من NIH Image Stack. يصف القسم التالي كيفية استخدام هذا المكدس مع Adobe Photoshop 3.0.

إذا كنت ترغب في تغيير التباين أو السطوع لأي من مستويات الألوان ، فيجب عليك تعديل الصور الأصلية أو تلك الموجودة في مكدس RGB. أقترح أن تقصر محاولاتك الأولية على الشرائح في مكدس RGB. عندما تقوم بتغيير ملف السطوع أو التباين من أي صورة واحدة ، يجب عليك بعد ذلك تطبيق طرفية (تحسين القائمة) لتلك الصورة المنفردة. لا تستخدم تطبيق طرفية إلى & quotStack & quot الماكرو حيث سيؤدي ذلك إلى تعديل جميع الصور في Stack.

من الأكوام حدد القائمة RGB إلى لون 8 بت. في مربع الحوار الناتج ، حدد & quotCustom Colors & quot. سيؤدي هذا إلى إنشاء نافذة & quotIndexed Color & quot من المكدس ، ولكنه لن يغير المكدس نفسه.

نظرًا لأن كل ملف أصلي قد يكون له توزيع مختلف للقيم (انظر المدرج التكراري) ، فقد يختلف تشبع كل مستوى لوني بشكل ملحوظ. كن مبدعًا ، جرب طرقًا مختلفة للقيام بذلك. (على سبيل المثال ، استخدم تعزيز التباين عملية على شريحة واحدة في كل مرة). جرب جداول البحث غير الخطية والمرشحات المختلفة وما إلى ذلك.

يمكن حفظ الصورة الناتجة & quotIndexed Color & quot باسم فريد.

بمجرد إتقان هذا التسلسل ، سيكون لديك فهم أوضح لعملية الماكرو & quot ؛ دمج صورتين & quot

إذا كنت الآن يحفظ مكدس RGB (RGB TIFF) في صورة NIH ، يمكن عرض الملف الناتج باستخدام Adobe Photoshop كملف 24 بت.

    دمج الملفات مع Adobe Photoshop

يسمح الإصدار 1.58 / 1.59 من NIH Image الآن بحفظ Stacks مباشرة بتنسيق Adobe Photoshop 3.0 TIFF.

أ) يجب أن تتكون المكدس من 3 شرائح.

ب) قبل حفظ المكدس ، افتح معلومات الشريحة في ال الأكوام قائمة. تأكد من تحديد RGB.

ج) يحفظ الملف. سيكتب الملف كملف RGB TIFF.

يمكنك بعد ذلك فتح مجموعة صور NIH مباشرة في Adobe Photoshop 3.0.

هناك وسيلة بديلة لتحويل المكدس إلى تنسيق RGB TIFF وهي استدعاء RGB إلى اللون وظيفة. سيؤدي هذا تلقائيًا إلى تغيير نافذة & quotSlice Info & quot إلى RGB. ستوفر الصورة & quotIndexed Color & quot الناتجة معاينة تقريبية (8 بت) للنتائج التي سيتم الحصول عليها باستخدام Adobe Photoshop (24 بت). يحفظ هذا الملف.

ستتمكن الآن من استخدام أدوات Adobe Photoshop المختلفة لتعديل الصورة الناتجة ذات 24 بت. يجب عليك استكشاف استخدام المستويات أمر (القيادة + L. ) ، وكذلك السطوع / التباين أمر (القيادة + ب ).

إذا كان لديك قسم مُسمى رباعي (أو أكثر) (على سبيل المثال ، 512 × 512 ، أربعة فلوروفور ، أو ثلاثة فلوروفور وصورة نومارسكي / مدينة دبي للإنترنت) ، وقمت بتخزينها في مكدس من أربع شرائح في صورة المعاهد الوطنية للصحة ، يمكنك فتحها في Adobe Photoshop باستخدام الطريقة الموضحة أدناه.

أ) من Adobe Photoshop ملف القائمة ، حدد افتح.

ب) باستخدام مربع حوار Adobe Photoshop Open ، انتقل إلى الدليل المطلوب الذي يحتوي على ملف NIH Image Stack ذي الأهمية.

ج) باستخدام نفس مربع الحوار ، اسحب القائمة في أسفل مربع الحوار ، اختر تنسيق الملف الخام.

د) سيعرض هذا جميع الملفات في المجلد المختار.

هـ) حدد حزمة صور المعاهد الوطنية للصحة التي تحتوي على الشرائح الأربع. عليك أن تعرف أبعاد الشرائح.

و) يطلب مربع الحوار الناتج أن تملأ:

ح) احفظ صورة Photoshop الجديدة باستخدام ملف حفظ باسم. صندوق المحادثة. لا تحفظ كصورة خام. حدد تنسيق TIFF ، واختر اسمًا جديدًا للملف ، وإلا فإن الأمر بسيط يحفظ سيقوم الأمر بالكتابة فوق ملف NIH Image الأصلي وتخزين البيانات بتنسيق Raw.

يمكنك تعديل كل قناة لون على حدة باستخدام عدة طرق مختلفة ، كما هو موضح في دليل Adobe Photoshop 3.0.

ستكون جودة الصورة الملونة الناتجة أفضل بشكل عام من تلك التي توفرها NIH Image ، حيث يمكنها استخدام جدول بحث كامل 24 بت ، ولا تتطلب ثبات الصورة.

سيوفر دليل Adobe Photoshop والبرنامج التعليمي مزيدًا من الإرشادات في تعديل الصور.

    الأسلوب المفضل

ج) قارن نتائج NIH Image دمج 8 بت مع Photoshop 24-Bit Merge

تعد جودة الصورة الملونة (بافتراض أن شاشتك مضبوطة على لون 24 بت) أفضل بشكل عام في Adobe Photoshop من الصورة المحسنة 8 بت التي تم الحصول عليها في صورة NIH.

د) ضبط تباين الألوان على أقسام في حزمة (راجع وحدات الماكرو)

افعل ال تعزيز التباين التشغيل بشكل منفصل على كل قسم في المكدس. سيؤدي عدم القيام بذلك إلى دمج كل من الصور المشبعة وغير المشبعة.

إذا كنت تتعامل مع قسم RGB واحد ، فستجد أن Adobe Photoshop يوفر أدوات أفضل بكثير لذلك.

هـ) دمج زوج مُسمى مزدوج من سلسلة Z باستخدام ماكرو

    افتح الأكوام. سيتم افتراض أن المكدس الأول هو & quotred & quot المكدس. المكدس الثاني سيكون & quotgreen & quot المكدس.

عيب هذا الإجراء هو أن الصور الناتجة 8 بت وليس 24 بت. لا يمكنني العثور على طريقة للقيام بهذا الإجراء باستخدام Adobe Photoshop.

2. إسقاط سلسلة Z ودورات ثلاثية الأبعاد

العديد من الصفات الأكثر قيمة لسلسلة Z متحد البؤر هي أنه يمكن معالجة البيانات للحصول على & quot؛ عروض من خلال & quot من المكدس ، ويمكن إعادة تقسيم المكدس في زوايا مختلفة لتحويل العرض المستعرض إلى مستوى سهمي أو أفقي ، ويمكن استخدامه في إنشاء صور ثلاثية الأبعاد وأزواج استريو وعمليات أخرى. في الواقع ، فإن NIH Image قادرة على إجراء العمليات بالإضافة إلى الكثير من البرامج التي تقدمها الشركات المصنعة للمجاهر متحد البؤر ، وتعادل العديد من العمليات الأساسية التي توفرها برامج معالجة الصور باهظة الثمن مثل VoxelView و VolVis و VoxBlast التي تعمل على Silicon محطة عمل الرسومات. لمزيد من العمليات التفصيلية باستخدام Voxels الحقيقي والتظليل المعقد وتتبع الأشعة في 24 بت ، تعد هذه البرامج الأخيرة اختيارات ممتازة. ومع ذلك ، بالنسبة للعمليات الأكثر شيوعًا ، فإن صورة المعاهد الوطنية للصحة مناسبة تمامًا.سيتم تحقيق الأداء الأمثل في هذه المهام باستخدام PowerPC بذاكرة كافية للتعامل مع مجموعات البيانات النموذجية.

أ) التنقل عبر سلسلة Z باستخدام الأكوام

    افتح سلسلة Z في Stack.

ب) تحريك سلسلة Z

    من مميز القائمة ، حدد فيديو للأفلام المتذبذبة. سيؤدي ذلك إلى إنتاج حركة سلسة ذهابًا وإيابًا للرسوم المتحركة Z-series.

هذه فائدة مفيدة للغاية للمجهر متحد البؤر. مكدس من أقسام السلسلة Z كلها في التركيز الأمثل. إذا تم الإسقاط على مستوى واحد ، فستكون الآن جميع الكائنات في جميع أنحاء سمك المقطع المصور في بؤرة حادة وقد تكون العلاقات المكانية أكثر وضوحًا.

يوفر الإصدار 1.58 من NIH Image والإصدارات الأحدث وحدات ماكرو لتنفيذ Z-projection. يتم تضمين نموذج ماكرو لإنجاز هذه العملية في ملفات الماكرو المصاحبة.

    تحديد منطقة الإسقاط Z

أ) اختر سلسلة Z ممتدة (على سبيل المثال ، أكثر من 10-20 صورة) مع ملفات تعريف محددة جيدًا للكائنات.

ب) قم بتشغيل الماكرو & quotProject Z Series & quot.

ج) الاستخدام مشروع أمر

د) يضع :
تباعد الشرائح (بكسل): اضبط تباعد الشرائح
الزاوية الابتدائية (0-359): 0
الدوران الكلي (0-360): 0
زيادة زاوية الدوران: 0
أقل شفافية ملزمة: 0
الحد الأعلى للشفافية: 100
عتامة السطح (0-100): 0
عمق السطح - جديلة (0-100): 100
العمق الداخلي - جديلة (0-100): 0

ه) يختار & quot تصغير حجم النافذة & quot

F) يختار & quotX- المحور & quot

ز) يختار & quotBrightest Point & quot

بعد أن تطور شعورك بالألفة مع البرنامج ، العب بقيم مختلفة. ابدأ بالقيم الافتراضية. بمجرد أن تصبح أكثر دراية بأداة Thresholding (Magic Wand) ، ستتمكن من استخدامها لتعيين نطاق القيم المطلوبة لسلسلة Z الخاصة بك.

سيؤدي هذا إلى إنشاء إسقاط Z واحد لجميع اللوحات في المكدس ، يتم عرضها مباشرة من أمام المكدس.

جرب زوايا عرض مختلفة باستخدام قيم مختلفة لـ & quotInitial Angle & quot ، مع ترك & quotTotal Rotation & quot عند 0.

إذا كنت ترغب في عمل زوج استريو سريع وقذر من الصور من سلسلة Z ، فيجب أن تكون القيم شيئًا مثل:


الزاوية الابتدائية (0-359): 356
الدوران الكلي (0-360): 8
زيادة زاوية الدوران: 8

حدد & quotY-Axis & quot كمحور & quot للدوران & quot. سيؤدي هذا إلى تدوير الصورة الناتجة من اليسار إلى اليمين (أي حول المحور ص). اختر & quotBrightest Point & quot ك & quot طريقة العرض & quot.

سينتج هذا حزمة جديدة تحتوي على صورتين بزيادة 8. هذه زاوية شائعة لأزواج الاستريو. من أجل تصور هذا ، يمكنك القيام بإجرائين مختلفين.

    من الأكوام قائمة، تحريك المكدس ، وستتأرجح الصورة ذهابًا وإيابًا حول المحور ص.

أ) تأكد من عدم تحديد & quotInvert Pixel Values ​​& quot في الملف تعديل التفضيلات عنصر القائمة. إذا تم التحديد ، قم بإلغاء تحديد هذا العنصر. ثم حدد تفضيلات الملف / التسجيل. استقال صورة المعاهد الوطنية للصحة من أجل تنفيذ التغييرات في التفضيلات. إذا تم اختيار هذا العنصر & quot ؛ فسيتم الخلط بينك وبين القيم المختلفة المعروضة في نوافذ المعلومات ورسم الخرائط والمدرج التكراري.

ب) هناك عدد من المعلمات في مشروع البند تحت الأكوام قائمة. يعد فهم الاستخدام الصحيح لهذا العنصر أمرًا بالغ الأهمية للحصول على نتائج مرضية في الإسقاطات Z والتناوب.

ج) يتضمن العنصر الأول من عدة عناصر إعدادات واضحة بخصوص & quotSlice Spacing & quot، & quotInitial Angle & quot، & quotTotal Rotation & quot و & quot؛ Rotation Angle Increment & quot. كل هذه القيم واضحة وتتعلق بالفاصل الزمني لأخذ العينات من الإسقاط الناتج.

العناصر المتبقية في القائمة ، & quotLower & quot و & quot ، حدود الشفافية العليا & quot ، & quot ، عتامة السطح & quot ، و & quot؛ عمق السطح Cueing & quot ، و & quot ، مع ذلك ، تعتبر محيرة للغاية ، ولا يمكن فهمها بسهولة دون بعض الشرح.

تتمثل إحدى أكبر الصعوبات في إتقان هذه الوظائف في أنه بمجرد تحديد إعدادات معينة ، والحصول على صورة ، ثم تجربة الإعدادات الأخرى ، ستصبح شاشتك مليئة بالصور ، وسيتم نسيان المعلمات المحددة المستخدمة للحصول عليها.

ابدأ بـ & quotLower & quot و & quotUpper Transparency Bounds & quot بالعلاقة مع أزواج الاستريو التي أنشأتها قبل بضع دقائق.

عند عمل إسقاط Z بطريقة عرض واحدة بسيطة ، يكون تباعد الشرائح غير ذي صلة. ومع ذلك ، اعتمادًا على إعداد & quotLower & quot و & quot أعلى حدود الشفافية & quot و & quot؛ عمق التلميح الداخلي & quot ، أو من المحتمل أن تظهر الصورة الناتجة تفتقر إلى السطوع إلى حد ما.

يجب تعيين & quotLower Transparency Bound & quot إلى 0. (لاحظ أنه يتم التعبير عن هذه القيمة من 0-254). تحدد هذه القيمة نقطة القطع لوحدات البكسل المعروضة. سيتم تجاهل جميع قيم البكسل الموجودة أسفل الإعداد المحدد وسيتم تعديلها إلى قيمة أغمق. تذكر أن البيكسل الأكثر بياضًا / ألمعًا على جهاز Macintosh له قيمة 0 ، والبكسل الأسود بقيمة 255. & quot ؛ الحد من الشفافية منضم & quot أكبر من 0 (على سبيل المثال ، n) ، سيعدل كل البكسلات من صفر إلى n في صورتك واستبدالها بـ وحدات بكسل أغمق. ينتج عن هذا ثقوب رمادية داكنة إلى سوداء في وسط جسم لامع. تحديد هذه القيمة بسيط للغاية. الطريقة الأكثر فاعلية لتقدير عواقب هذا الاختيار هي النظر إلى الرسوم البيانية للصور التي تم إنتاجها باستخدام & quot؛ Lower Transparency Bound & quot مضبوطة على الصفر ، ومقارنتها بالرسم البياني الذي تم إنشاؤه باستخدام & quotLower Transparency Bound & quot من 50 ربما. تأكد من أن صورة البداية الخاصة بك له كائنات بارزة بقيم مؤشر سطوع الرسم البياني من 1-10 (خارج نطاق من 0-255).

بالنسبة لـ & quotUpper Transparency Bound & quot ، أقترح أن تبدأ بقيمة 254. بعد استخدام هذا لفترة من الوقت ، العب بقيم أخرى.

الوظائف الثلاث التالية في مشروع يتم التعبير عن مربع الحوار كقيم من 0-100٪.
عتامة السطح (0-100): 0
عمق السطح - جديلة (0-100): 100
العمق الداخلي - جديلة (0-100): 0

تقوم NIH Image 1.61 بتعيين & quotInternational Depth-Cueing & quot إلى القيمة الافتراضية 50. وهذا سينتج & quotmuddy & quot الصور. يجب عليك تعيين هذا على 0.

د) إعادة تقسيم السلسلة Z على طول المستويات البديلة: (X-Z و Y-Z و Theta-Z)

تتمثل إحدى الميزات الأكثر فائدة لـ NIH Image في القدرة على إعادة تقسيم مكدس بيانات Z-series بسرعة على طول المستويات البديلة. بالإضافة إلى الطائرات المتعامدة البسيطة (على سبيل المثال ، X-Z و Y-Z) ، يمكنك إعادة الشريحة بأي زاوية عشوائية بين X و Y لإنشاء مقطع عرضي Z واحد. هذا مفيد جدًا لتقييم مدى تغلغل الأجسام المضادة في الأنسجة ، وتقييم تباعد الخلايا ، إلخ.

كلما اقتربت الصور في السلسلة Z الأصلية ، وزاد عددها ، كلما كانت النتائج النهائية أكثر طبيعية. من أجل توفير صورة مستمرة على ما يبدو في المستوى الذي تم إعادة عرضه ، يقوم البرنامج بإقحام القيم الرمادية. لتحسين جودة الصور التي تم إعادة نسخها ، يجب أن تكون سلسلة Z الأصلية أقرب ما يمكن (على سبيل المثال ، 0.25 م).

هل قمت بضبط معايرة التكبير وتباعد الشرائح ، كما هو موضح أعلاه؟ (انظر أيضًا دليل صور المعاهد الوطنية للصحة).

قد يحتوي ملف البيانات الأصلي على المعلومات المطلوبة حول تباعد الشرائح. في العديد من ملفاتنا ، كان حجم الخطوة 0.38 م (على BioRAD) ، وحجم البكسل 0.105 م (9.5 بكسل لكل م). ومع ذلك ، يعتمد هذا على حجم خطوة المحور Z والهدف وعامل التكبير / التصغير.

أ) من الأكوام القائمة ، حدد خيارات . أدخل القيمة المناسبة في مربع حوار تباعد الشرائح.

ب) حدد صورة من السلسلة التي تعرض أفضل ميزات الاهتمام. باستخدام أداة المعايرة / القياس (خط متقطع في العمود الأيمن من لوحة الأدوات) ، ارسم خطًا عبر القسم على طول المستوى المطلوب للتقطيع. إذا كنت ترغب في تقييد المستوى على المحور X أو المحور Y ، فاضغط على مفتاح Shift مع الاستمرار أثناء رسم الخط.

ج) من الأكوام القائمة ، اختر Reslice (أمر / ). إذا ظهرت ملفات التعريف الدائرية مسطحًا بشكل مفرط في أي من المحور X أو المحور Y ، فجرّب قيمًا مختلفة لـ & quotSlice Spacing & quot في خيارات الحوار.

ه) إعادة إنشاء سلسلة Z في مستوى بديل

تصف الإرشادات السابقة كيفية الحصول على شريحة واحدة في المستوى X-Z أو YZ. إذا كنت ترغب في الحصول على مكدس جديد من قسم سلسلة Z ، وليس قسمًا واحدًا فقط ، فاستخدم الماكرو المقدم ، & quotReslice Horizontally & quot أو & quotReslice Vertically & quot. يقتصر إعادة التشكيل على المستويات المتعامدة للقسم. وبالتالي ، إذا كنت ترغب في إعادة التقطيع بزاوية مائلة ، فسيتعين عليك أولاً تدوير المكدس. للقيام بذلك ، استخدم أداة Angle Measurement من Tool Palette. قم بقياس درجات تباين الكائن في الصورة من الزاوية التي تريدها أخيرًا.

أ) استخدم الماكرو & quotScale و Rotate Stack & quot ، باستخدام قيمة الزاوية المحددة في الفقرة السابقة.

ب) حدد الآن منطقة مستطيلة تحيط بالمنطقة التي تريد إعادة تقسيمها إلى مستوى أفقي أو عمودي.

ج) استخدم الماكرو & quotReslice Horizontally & quot أو & quotReslice Vertically & quot.

1. سريع ديناميكي 3D Reslicing

ساهم نوربرت فيشر الهولندي مؤخرًا في إنشاء ماكرو مفيد للغاية ، & quot ؛ تقطيع ثلاثي الأبعاد & quot ، لإعادة تكرار مجموعة من الأقسام على طول المحاور X و Y و Z. يتم توفير هذا الماكرو في البرنامج & quotObject-Image 1.59 & quot ، المتاح من موقع NIH Image FTP. يوفر Object-Image 1.59 إعادة تقسيم سريعة للغاية في الوقت الفعلي. لا يمكن حفظ المقاطع الفردية التي تم إعادة نسخها ، لأنه على عكس وحدات الماكرو الموضحة أعلاه ، لا يتم وضعها في مكدس جديد. يتم إنجاز إعادة تقسيم المقاطع عن طريق سحب الماوس على طول المحاور X أو Y أو Z لمكدس رئيسي ، وينتج عن ذلك توليد سريع للصور التي تم إعادة نسخها في المستويين الأخريين. لا يمكن إجراء إعادة النسخ إلا على طول المستويات المتعامدة.

أ) افتح كومة Z من المقاطع ، مثل عينة صور التصوير بالرنين المغناطيسي لجمجمة بشرية ودماغ.

ب) أدخل مقياس التكبير الصحيح وتباعد الشرائح (5.0 مم) ، كما هو موضح أعلاه.

ج) تحت الأكوام القائمة ، حدد آلة تقطيع ثلاثية الأبعاد. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة تحتوي على عرض منظور بزاوية للمكدس الأصلي ، مع مستويات عرض ثلاثية الأبعاد على طول المستويين البديلين أيضًا. في الجزء العلوي من النافذة ستكون صورة للقسم الذي تم إعادة عرضه موازيًا للمحور السيني. على الجانب الأيمن من النافذة ، سيكون القسم المعاد تقطيعه موازيًا لمحور Y.

د) ضع الماوس فوق الهامش X أو Y أو Z. يتغير شكل المؤشر إلى سهم برأسين يشير إلى اتجاه الحركة. اسحب المحور X- أو Y- أو Z- على الصورة المركزية الرئيسية ، ولاحظ القطع السريع في المستويات البديلة.

هـ) ضع الماوس فوق تقاطع المحورين X و Y وسيصبح المؤشر سهمًا رباعي الرؤوس. يمكنك الآن إعادة الشرائح بالتوازي مع كل من المحورين X و Y في نفس الوقت.

و) سيؤدي النقر المزدوج بالماوس على المحورين X أو Y إلى إيقاف تشغيل أداة إعادة التشكيل لهذا المحور. سيؤدي النقر المزدوج على الخطوط المتقطعة على المحور X أو المحور Y إلى استعادة مستويات إعادة التشكيل.

F) توليد سلسلة ثلاثية الأبعاد من السلسلة A.

هذا إجراء حسابي مكثف. سوف يثبت PowerPC السريع أنه مرغوب فيه للغاية عند القيام بهذه العملية. عندما لا تزال تتعلم أساسيات هذا الإجراء ، استخدم أداة التحديد من Tool Palette وحدد جزءًا صغيرًا من الصورة عند إنشاء سلسلة ثلاثية الأبعاد. سوف تكمل المهمة بسرعة أكبر.

استخدم الرعاية في الإعدادات. تذكر أن تقوم بتصحيح السماكة والتباعد بين الأقسام الفردية.

    يختار مشروع من الأكوام قائمة.

    يضع:
    الزاوية الابتدائية (0-359): 0
    الدوران الكلي (0-360): 15
    زيادة زاوية الدوران: 180

حدد & quotY-Axis & quot كمحور & quot للدوران & quot. سيؤدي هذا إلى تدوير الصورة الناتجة من اليسار إلى اليمين (أي حول المحور ص). اختر & quotBrightest Point & quot ك & quot طريقة العرض & quot.

الآن انقر فوق موافق وانتظر. سيقوم البرنامج بإنشاء كومة جديدة من الصور للأشياء & quot؛ تدوير & quot في الحزمة الأصلية.

بمجرد حصولك على مزيد من الخبرة في هذا الإجراء ، مشروع باستخدام دوران كامل بزاوية 360 درجة على فترات زمنية أقرب ، وتغيير قيم الشفافية ، ومحاور الدوران والعديد من الخيارات الأخرى المتاحة.

يتم توفير ماكرو لتسهيل هذه العملية.

ز) تحريك سلسلة ثلاثية الأبعاد (إنتاج وتوزيع تناوب ظاهري ومثل)

تحت مميز القائمة ، حدد خيارات الفيديو . تحقق من & quotOscillate Movies & quot. أغلق مربع الحوار.

لإنشاء انطباع بالدوران باستخدام مكدس ثلاثي الأبعاد تم إنشاؤه حديثًا ، استخدم ملف الأكوام القائمة وحدد تحريك (الأمر + = ). هذا يعتمد بشكل كبير على الذاكرة ، لذا حافظ على جهودك الأولية صغيرة.

يمكنك التحكم في سرعة الدوران بالمفاتيح 1-9. يمكنك التنقل عبر أقسام فردية باستخدام مفتاحي & lt و & gt.

ح) عمل زوج ستيريو أو سلسلة من أجهزة ستريو؟

هناك عدة طرق لتوليد صور مجسمة من كومة من المقاطع التي تم جمعها في المستوى Z. إحدى الطرق البسيطة ، طريقة & quotpixel shift & quot ، هي تلك المستخدمة في برنامج BioRAD الأصلي.

تبدأ طريقة إزاحة البكسل بكومة من سلسلة Z. سوف تولد اثنين من الإسقاطات Z من هذا المكدس الأصلي. سيتم تحويل أحدهما & quot؛ بكسل & quot؛ إلى اليسار & & quot؛ بكسل & quot؛ إلى اليمين. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزاحة كل قسم متتالي في المكدس بمقدار بكسل إضافي واحد (أو أكثر ، إذا رغبت في ذلك) قبل تنفيذ الإسقاط على شكل Z. ثم يتم وضع الصورتين الناتجتين جنبًا إلى جنب. تقتصر طريقة إزاحة البكسل بشكل عام على صور الاستريو المتمركزة حول المستوى الأصلي لمجموعة الصور.

يعد الإسقاط وتتبع الشعاع طريقة ثانية تقوم بإسقاط (تتبع الأشعة) المكدس على مستوى عرض وهمي من زوايا رؤية مختلفة وإنشاء سلسلة دوران ثلاثية الأبعاد. هذه الطريقة الثانية أكثر تعقيدًا من الناحية الحسابية ، ولكنها توفر إمكانية إنشاء مناظر استريو من أي زاوية حول نقطة مركزية.

ابدأ مع Z-series Stack الأصلي. حدد ملف مشروع من الأكوام قم بتعيين & quotInitial Angle & quot إلى 354، & quotIncrement Angle & quot إلى 6 و & quot

1. سلسلة ستيريو باللونين الأبيض والأسود

بمجرد إنشاء سلسلة ثلاثية الأبعاد ، قم بعمل ملف مونتاج سلسلة باستخدام الوظيفة المناسبة من الأكوام قائمة. ال مونتاج الوظيفة غير مدمرة ، أي أنها لا تمسح المكدس ثلاثي الأبعاد ، ومع ذلك ، أقترح عليك ذلك يحفظ عملك كما تمضي قدما.

أ) قائمة الأكوام: مونتاج

سيظهر مربع الحوار الناتج سلسلة من القيم التي تعتمد على عدد الأقسام في المكدس. إذا أنشأت مكدسًا بسيطًا من 3 أقسام فقط ، فاختر صفًا واحدًا و 3 أعمدة ، وزيادة 1. إذا قمت بإنشاء سلسلة دوران كاملة 360 درجة ، فيمكنك تحديد أي نطاق من الشرائح (على سبيل المثال ، الشرائح # 4-8 خارج من 16 شريحة) ، أو شرائح تزايدية (كل شريحة ثانية أو ثالثة في المكدس) ، وحدد عدد الصفوف والأعمدة التي ترغب في عرضها.

سيؤدي هذا إلى إنشاء سلسلة من الصور في نافذة جديدة على الشاشة. إذا كانت الصور الناتجة أكبر من أن تصطف بجانب بعضها البعض ، فاستخدم عامل تغيير الحجم عند إنشاء المونتاج.

ابدأ بصورتين متجاورتين. لتسهيل رؤية تأثير الاستريو بدون عارضين خاصين ، اختر مجموعة من الصور ذات كائن بارز لتوفير إشارة محاذاة في وسط كل صورة. اضبط حجم الصورة والفصل مع عدم وجود مسافة بين إشارات المحاذاة أكثر من 50 مم على الشاشة. اعمل تدريجياً في طريقك إلى فواصل أكبر ثم صور أكبر قليلاً. في البداية ، قد تجد أنك تحتاج إلى عارض استريو لتصور صورة مجسمة من الصور جنبًا إلى جنب. مع الممارسة ، لن تحتاج إلى عارض استريو ويجب أن تكون قادرًا على المسح عبر أزواج من الأقسام والانتقال من صورة استريو إلى أخرى. (تبلغ المسافة النموذجية بين الحدقتين لمعظم الأشخاص حوالي 65 مم. يمكنك أيضًا التدرب على تعلم دمج صور الاستريو باستخدام بعض الكتب الشائعة الحديثة باستخدام & quotrandom dot stereograms & quot ، مثل The Magic Eye.)

2. زوج ستيريو من مقطع واحد يسمى بالألوان

تتمثل الطريقة البديلة لتقديم صور الاستريو في دمج زوج استريو في مستوى صورة واحد ، وتعيين صورة واحدة إلى اللون الأحمر والأخرى إلى اللون الأخضر.

لإنشاء سلسلة استدارة ثلاثية الأبعاد حول محاور Y ، حدد عدد الصور إلى اثنين عند فصل ca. 6-12. بالنسبة للتجارب الأولى ، قم بتعيين & quotInitial Angle & quot إلى 354 ، و quotIncrement Angle & quot إلى 6 و & quotTotal Rotation & quot إلى 12. سيؤدي ذلك إلى إنشاء ثلاث لوحات في مكدس جديد. تحريك كومة الصور الجديدة ، وإذا كانت الرسوم المتحركة تنتج التأثير المطلوب ، فاحذف اللوحة الوسطى أو إحدى لوحات النهاية. يضيف طبق أسود على شكل شريحة 3/3. (راجع القسم أعلاه حول دمج الشرائح لإنشاء صور ملونة 8 بت). باستخدام الأكوام عنصر القائمة RGB إلى لون 8 بت ، ستحصل على صورة مدمجة واحدة يمكن عرضها بزوج من نظارات الاستريو الحمراء / الخضراء.

كلما زاد الفصل بين الألواح (أي 12 بدلاً من 6) زاد تأثير الاستريو بشكل مبالغ فيه. العب بقيم مختلفة. يجد بعض الناس أن الزوايا الأكبر من 15-18 مفرطة.

3. صور استريو ملونة لقسم مزدوج المسمى

على الرغم من أن هذه مجموعة أكثر تعقيدًا من العمليات ، إلا أنها امتداد منطقي للطرق الموضحة أعلاه.

قم أولاً بإنشاء سلسلة دوران ثلاثية الأبعاد لكل سلسلة Z لقسم مزدوج التسمية. يحفظ النتائج. قريب جميع النوافذ باستثناء تلك الخاصة بسلسلتي التدوير ثلاثي الأبعاد. الآن استخدم الماكرو & quotColor Merge of Two Stacks & quot. سيكون لديك الآن سلسلة تناوب (ثلاثية الأبعاد) من نوعين مختلفين من الفلوروفور في وقت واحد. تحريك السلسلة.

الآن قم بإنشاء أزواج استريو باستخدام طريقة المونتاج الموضحة أعلاه.

I) تصدير مكدسات إلى أفلام QuickTime وتسجيلات VCR للأكوام

يمكن حفظ سلسلة Z الدورية ، أو أي Stack آخر ، بتنسيق QuickTime ، مما يسمح بمشاهدتها مع مجموعة متنوعة من البرامج الأخرى ، مثل برنامج QuickTime Viewer البسيط ، أو باستخدام برنامج مصمم لإعداد المقاطع ونسخها على جهاز VCR ، مثل Avid VideoShop 3.0. يتم توزيع البرنامج الأخير حاليًا بدون تكلفة إضافية مع العديد من أجهزة كمبيوتر Apple. يمكن استخدام Avid Videoshop لإعداد شريط VCR لبياناتك ، ودمج مجموعات البيانات المختلفة في تسلسل واحد ، إلخ.

    حفظ مكدسات في تنسيق كويك تايم

أ) يحفظ المكدس في تنسيق صورة المعاهد الوطنية للصحة القياسي.

ب) افتح المكدس ، وحدد حفظ باسم.

ج) توجد سلسلة من الأزرار الاختيارية في أسفل مربع الحوار ، بما في ذلك TIFF و PICT و PICS وغيرها.

هـ) إعادة تسمية الملف باسم جديد (على سبيل المثال ، إذا كان اسم الملف & quotNewCell & quot ، فقم بإعادة تسميته & quotNewCell.PICS & quot) لتجنب الكتابة فوق ملف البيانات الأصلي.

و) لا يزال من الممكن فتح الملف الجديد كمكدس داخل صورة المعاهد الوطنية للصحة.

ز) إذا كنت يحفظ الملف ، فسيعود إلى تنسيق TIFF الأصلي ، على الرغم من استخدام اسم الملف الجديد ، ومن المحتمل أن يكون محيرًا عند محاولة فتحه باستخدام مشغل QuickTime. لذلك ، أي إضافية يحفظ يجب أن تتم العمليات دائمًا باستخدام حفظ باسم. .

1. طابعة فيديو

يمكنك الحصول على طباعة فورية لنافذة صورة المعاهد الوطنية للصحة باستخدام طابعة فيديو ، مثل ميتسوبيشي 67U أو طابعة الفيديو الحرارية من سوني. يوفر هذا طباعة بمقياس رمادي. تنتج Mitsubishi طبعة تبلغ حوالي 3 × 4 بوصات ، وتوفر سجلاً جارياً لنتائجك. تقوم شركة Scion بتسويق لوحة NuBus (TV-3) التي سترسل مباشرة محتويات النافذة المحددة إلى جهاز NTSC. يجب وضع برنامج تشغيل لوحة TV-3 في مجلد NIH Image Plug-Ins. عيب TV-3 هو أنه يمكنه فقط إرسال صورة بأبعاد قصوى تبلغ 640 × 480 بكسل. نظرًا لأن صورة BioRAD القياسية هي 768 × 512 ، يجب أولاً تغيير حجم الصورة إلى حجم 640 × 480 ، أو تحديد جزء من الصورة يتوافق مع هذا الحجم. الصور الأصغر من 640 × 480 سوف تملأ فقط جزء من الحقل المطبوع. سيكون من المفيد إذا قدم السائق وظيفة قياس تلقائي. ومع ذلك ، يمكن كتابة ماكرو بسيط لتحقيق نتيجة مماثلة. يوفر PowerPC 8500 الجديد خرج NTSC و S-Video مباشرًا. لم تتح لي الفرصة لاختبارها باستخدام طابعة Mitsubishi ، ولكن بناءً على المواصفات المنشورة ، يجب أن توفر هذه النتائج نتائج مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام لوحة Scion TV-3.

2. طابعة صبغ التسامي

يمكن الحصول على مطبوعات ذات جودة أفضل ، بما في ذلك المطبوعات بالأبيض والأسود أو الألوان ، باستخدام طابعة تسامي الصبغة Kodak 8600. الطابعة مزودة ببرنامج تشغيل Adobe Photoshop Plug-In. ضع هذا المكون الإضافي في المجلد الذي يحمل نفس الاسم في دليل صورة المعاهد الوطنية للصحة الرئيسي. عندما تريد طباعة محتويات النافذة ، حدد الصورة المطلوبة. تحت ملف القائمة ، اختر يصدر ، وحدد & quotKodak 8600 & quot برنامج تشغيل الطابعة. ستتم طباعة الصورة النموذجية في غضون دقيقة واحدة تقريبًا. إذا كنت في صورة المعاهد الوطنية للصحة ، فهذا يعمل فقط مع الصور أحادية اللون المطبوعة على شريط أسود. من الأفضل إنتاج المطبوعات الملونة باستخدام Adobe Photoshop. يتمثل أحد القيود الرئيسية في استخدام طابعة Kodak في تكلفة كل طباعة (2 إلى 3 دولارات أمريكية) ، بالإضافة إلى تكلفة الطابعة نفسها (حوالي 8000 دولار أمريكي).

قد يوفر التوافر الواسع لطابعات الليزر الملونة مطبوعات ملونة مرضية بتكلفة أقل من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام طابعة Kodak 8600.

3. صانع الشرائح

هناك عدد من صانعي الشرائح ، بما في ذلك LFR Lasergraphics و GCC / Polaroid slidemaker و Agfa وغيرها.

إذا كنت تستخدم Microsoft PowerPoint لإرسال الصور إلى صانع الشرائح ، مقياس الصور بالحجم الكامل للشاشة (على سبيل المثال ، 768 × 512) قبل حفظها. استخدم & quotBilinear Interpolation & quot ، بدلاً من & quotNearest Neighbor & quot ، للحصول على أفضل النتائج. يمكنك أيضًا استخدام PowerPoint لدمج صور مختلفة في شريحة واحدة أو إضافة نص أو عناصر رسومات أخرى. معجون صور المعاهد الوطنية للصحة على خلفية سوداء لتجنب وجود حدود بيضاء حول الصورة.

أصبحت مشغلات أشرطة الفيديو متاحة الآن بشكل عام في جميع الجامعات والاجتماعات العلمية. قد تجد أنه أكثر فاعلية لعرض الإسقاطات الدوارة بالإضافة إلى تسلسل المقاطع على شريط فيديو ، بدلاً من عرض الشرائح 2 × 2 أو النفقات العامة. تتوفر تقنية نقل مثل هذه الأكوام على نطاق واسع ، ويتم وصف وصف موجز لتطبيقها على NIH Image ومكدس متحد البؤر في القسم السابق.

سابعا. استخدام صورة المعاهد الوطنية للصحة لجمع الصور والتحكم في الأداة

غالبية CLSMs لديها برامج مخصصة خاصة بهم لجمع الصور. ومع ذلك ، فقد تم أيضًا استخدام العديد من الأدوات ، مثل الماسح الضوئي ذو الشق المباشر من BioRAD ، والماسح الضوئي في الوقت الحقيقي AOD من Noran مباشرة مع NIH Image لجمع البيانات.

ثامنا. زائدة

تم توفير مجموعة من وحدات الماكرو للاستخدام مع الصور (كنفوكل) ، وكذلك لجمع الصور الفلورية باستخدام CCD متكامل. يمكن العثور عليها في ملف منفصل بعنوان & quot صورة وحدات ماكرو لـ CLSM & quot. يمكن استخدامها مباشرة مع صورة المعاهد الوطنية للصحة دون تعديل. ومع ذلك ، قد تجد أن تفضيلاتك الشخصية تختلف عن تفضيلاتي ، ويمكنك تعديل وحدات الماكرو لتناسب احتياجاتك بشكل أفضل. راجع دليل Mark Vivino الممتاز حول برمجة الماكرو باستخدام صورة NIH ، والمتوفر من موقع FTP المعتاد (zippy.nimh.nih.gov/pub/nih-image/).

إذا كنت ترغب في تحميل وحدات الماكرو هذه تلقائيًا في كل مرة تبدأ فيها تشغيل صورة NIH ، فضعها في نفس المجلد مع البرنامج أو في مجلد النظام. قبل أن تفعل ذلك ، يحفظ الإصدار الحالي من & quot صورة وحدات الماكرو & quot باستخدام اسم بديل. أعد تسمية نسخة من & quotImage Macros for CLSM & quot as & quotImage Macros & quot.

في المرة التالية التي تبدأ فيها تشغيل صورة NIH ، سيتم تحميل وحدات الماكرو هذه كمجموعة افتراضية. راجع دليل NIH Image للحصول على مزيد من التفاصيل حول تحميل وحدات الماكرو.

التاسع. إضافة إلى دليل المعاهد الوطنية للصحة للتصوير المتزامن

إضافات مارس 1995

    وحدات ماكرو لدمج جوانب صورة BioRAD المنقسمة على الشاشة. ماكرو لمبادلة الشرائح الحمراء والخضراء من RGB Stack.

    نقل صور NIH Image RGB إلى Adobe Photoshop 3.0

    استخدام صورة المعاهد الوطنية للصحة للتقييم المسبق للفلورة - التحكم في تكامل الغالق والرقائق. يوفر سلسلة من وحدات الماكرو للتحكم في الغالق ، والتكامل على الشريحة ، وإنشاء مجموعات Stacks جديدة والعمليات ذات الصلة.

يتم ترتيب وحدات الماكرو هذه حسب تفضيلاتي الشخصية (أكثر أو أقل). ربما لن يرضي هذا الطلب أي شخص آخر. إذا قمت بإعادة ترتيب وحدات الماكرو هذه ، فتأكد من توخي الحذر فيما يتعلق بتعريف & quot المتغيرات والإجراءات & quot. يجب وضعها جميعًا في الملف أمام وحدات الماكرو التي تستدعيها.

تحديد إجراءات التكديس
خطأ في الإجراء (أخطاء: سلسلة)
الإجراء CalibrateImage
إجراء CheckForStack
إجراء CheckForSelection
إجراء GetSliceRange (ذكي: منطقي)
الإجراء GetSliceSequence (ذكي: منطقي)

بعض العمليات العالمية
ماكرو "[P] طباعة الفيديو"
ماكرو "[Q] Get Path"
ماكرو "[F2] معايرة الصورة"

عمليات على ملفات متحد البؤر: استيراد ، تقسيم ، دمج
ماكرو [=] & quotAnimate & quot
الإجراء ShowBioRadInfo (InfoOffset: عدد صحيح)
ماكرو "[F1] استيراد Biorad Z Series"
الماكرو "[S] دمج Split BioRAD"
ماكرو "دمج ألوان صورتين"
الماكرو "دمج الألوان اثنين من مكدسات"
الماكرو "Separate SplitScreen Z Stack"
ماكرو "[F5] RGB إلى مفهرس"
ماكرو "[W] Swap Red_Green"
الماكرو "دمج مكدسين"

عمليات التكديس العامة
ماكرو "جعل حجم المكدس الصورة الأمامية"
ماكرو '[F8] فلاش لتكديس
الماكرو MakeStack w_Current Image '
ماكرو "إضافة شريحة"
ماكرو "[A] إضافة شريحة سوداء"
ماكرو "[D] حذف الشريحة"

ضوابط الغالق والتكامل على الرقاقة
ماكرو "أوتوشتر"
الإجراء ResetShutter
ماكرو "[O] فتح الغالق"
ماكرو "[C] إغلاق المصراع"
ماكرو "[T] Trigger Shutter"
الماكرو "[R] إعادة تعيين المصراع"
الماكرو "[G] فتح الغالق - الإمساك - الإغلاق"
إجراء EndIntegration
تكامل الإجراء (الوضع: سلسلة)
ماكرو "[F6] دمج على الرقاقة باستخدام Cohu"
ماكرو "[F7] دمج صورة واحدة على Cohu"
ماكرو "[2] SetIntegrate: 2 Frames"
ماكرو "[F] إظهار nFrames"
ماكرو "دمج الضوء الأبيض"
ماكرو "مباشر"
ماكرو "متوسط"
ماكرو "[F1] استيراد Biorad Z Series"
ماكرو "[F2] معايرة الصورة"

تعديلات المكدس ، الإسقاطات Z ، أزواج ستيريو
الماكرو "Smooth Stack"
الماكرو "Sharpen Stack"
ماكرو "[I] Invert Stack"
ماكرو "تقليل الضوضاء المكدس"
ماكرو "[L] تطبيق LUT على المكدس"
ماكرو "[F0] إزالة 0 و 255 من المكدس"
الماكرو "Flip Stack Vertical"
الماكرو "Flip Stack Horizontal"
ماكرو "مسح المكدس الخارجي"
إجراء CropAndScale (سريع: الزاوية المنطقية: حقيقي)
ماكرو "[E] اقتصاص وتوسّع سريع"
ماكرو "اقتصاص وتنسيق سلس"
الماكرو "استدارة لليسار"
الماكرو "استدارة لليمين"
الماكرو "استدارة"
الإجراء DoReslicing (أفقيًا: منطقي)
الماكرو "[H] إعادة التصنيف أفقيًا"
الماكرو "[V] إعادة الرقاقة عموديًا"
ماكرو "[F12] Z إسقاط"
ماكرو "[F14] إنشاء عروض استريو"

التلاعب طرفية
الماكرو "Invert LUT"
الماكرو "Log Tranform"
ماكرو "[M] Gamma Tranform"
الماكرو "إعادة تعيين LUT"
الماكرو "Set Pixels Red"
ماكرو "تقريبًا رمادي LUT"
ماكرو "[U] Move Slice Up"
ماكرو "[Y] تحريك شريحة لأسفل"