معلومة

تصحيح الخلفية عند قراءة ELISA باستخدام ركيزة TMB

تصحيح الخلفية عند قراءة ELISA باستخدام ركيزة TMB


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم ببعض تطوير ELISA ، وأود بعض التبرير / أفضل الممارسات لتصحيح الخلفية. أنا أستخدم نظام الكشف عن الفجل الحار (HRP) جنبًا إلى جنب مع ركيزة TMB ومحلول إيقاف قائم على الحمض ، وهو أمر شائع جدًا. عندما يتم شق TMB بواسطة HRP ، فإنه ينتج لون أزرق (أقصى امتصاص (Aالأعلى) من 650 نانومتر) المنتج. لا تؤدي إضافة الحمض إلى إيقاف التفاعل لاكتشاف نقطة النهاية فحسب ، بل إنها تضخم الإشارة مرتين إلى ثلاثة أضعاف ، وتحول المحلول إلى اللون الأصفر ، بحيث يجب قراءته عند درجة Aالأعلى 450 نانومتر. يفترض أن الحمض نفسه يحتوي على Aالأعلى 540 نانومتر ، وهذا هو السبب في أنه يجب عليك استخدام هذا الطول الموجي لتصحيح الخلفية ، وطرحه من A450. تزعم مصادر أخرى أن أ540 من المفترض أن تصحح القراءة "العيوب البصرية" في اللوحة.

باستخدام أي من هذه التفسيرات ، يمكن للمرء أن يفترض أن A540 ستكون موحدة نسبيًا عبر اللوحة ، بغض النظر عن A450 من نفس البئر. ومع ذلك ، في تجربتي ، هذا ليس هو الحال على الإطلاق. يبلغ متوسط ​​الفراغات وعناصر التحكم السلبية الخاصة بي حوالي 0.041 وحدة امتصاص (AU) عند 540 نانومتر ، بمتوسط ​​A450 حوالي 0.065. ومع ذلك ، فإن A.450 من 0.9 يعطي A540 من 0.051 ، 1.4 يعطي 0.6 ، 2.0 يعطي 0.73 ، و 3.5 يعطي حوالي 0.14. يبدو أن طيف الامتصاص (الشكل 2) للركيزة ضئيل للغاية عند 540 نانومتر ، فلماذا أرى هذه الزيادة المعتمدة على الجرعة مثل A450 يزيد؟

بشكل عملي ، كيف أقوم بتصحيح الخلفية؟ حاليًا ، أقوم بطرح A لكل بئر فردي540 من أ450. هل يجب أن أواصل هذه الممارسة ، أم يجب أن أحدد خلفية لوحة متوسطة عند 540 نانومتر باستخدام الفراغات وعناصر التحكم السلبية ، وطرح تلك القيمة من كل فرد A450?


استخدام أطوال موجية مختلفة كمرجع يعطي بعض المزايا. يمكنك قياس خط الأساس لكل بئر. قد لا يكون لكل بئر نفس خط الأساس لأن كل بئر قد لا يكون هو نفسه تمامًا مثل الآخرين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكنك عمل خدوش عليه ، أو لمس الجزء السفلي ، أو الحصول على بعض الأوساخ من مقعدك. ويمكن تصحيح ذلك عن طريق A540 في حالتك. لذا ، فإن الاختلافات في النطاق الأدنى ليست مهتمة كثيرًا. في بعض الأحيان ، حتى إذا اخترت الطول الموجي حيث يبدو أن الامتصاص لا يتغير بعد التفاعل ، فقد يكون هناك تغيير طفيف. لا يتعلق هذا بالأثير ، لأن كلا الامتصاصيين يعتمدان على التركيز ما لم تتغير الحالات في المحلول (من المجمعات أو شيء من هذا القبيل).

ولكن مع ذلك ، تحصل على خلفية عالية من العينات التي تظهر 1.4 أو أكثر في A450. ليس لدي خبرات في هذه الركيزة ، ولكن قد ترغب في التفكير في عدة احتمالات: 1) قد تحصل على فقاعات في الجزء العلوي من الحل الخاص بك في الآبار ، 2) قد لا تحصل على قيم دقيقة لأن OD مرتفع للغاية ، 3) قد يحصل المحلول على رواسب 4) قد يكون هذا احتمالًا أقل ، ولكن يحدث بعض التفاعل الثانوي.

لـ 2) و 3) و 4). قد ترغب في التحقق من الخطية عن طريق رسم منحنى قياسي ، وتجنب استخدام النطاق الذي ينحرف عن العلاقة الخطية.

ملاحظة: يجب أن أذكر أنك ستتحقق من مواصفات قارئ اللوحة الخاص بك. يمكن أن يكون OD = 3 طريقة عالية لقياسه. لأن شدة الضوء تنخفض إلى ألف على الرغم من مسار الضوء 1 سم عند OD = 3. من الصعب جدًا قياس مثل هذه الأضواء الضعيفة بالضبط. ربما تشير العديد من مواصفات أجهزة قراءة اللوحات إلى أنه يمكنك قياس ODs حتى حوالي 2 ، لكن يعتقد بعض الناس أنه من المثالي قياس ODs حتى حوالي 1.


ما هي الضوابط لاستخدامها في فحوصات ELISA؟

مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) الموثوقة لتقدير المواد المستهدفة تعتمد بشكل حاسم على عناصر تحكم مختارة بعناية - إنها أبجديات ELISA: إنها كلها أنوبة بإندينغ جontrols.

لفهم أنواع عناصر التحكم وأي منها يتم تطبيقه ، من المهم فهم الأنواع المختلفة من ELISAs أولاً (راجع الملاحظة الفنية الخاصة بنا "ما هي الاختلافات بين أنواع اختبار ELISA؟" للحصول على مراجعة أكثر تعمقًا). لدى ELISA المباشر احتياجات مختلفة لعناصر التحكم عن الساندويتش أو ELISA التنافسية ، والوسائل المختلفة لإعداد العينة أو الكشف عنها تتطلب ضوابط مختلفة أيضًا.

هناك ثلاثة أنواع رئيسية من مبادئ ELISA. في ELISAs المباشر ، يتم تغليف العينة على اللوحة ويتم الكشف عن المستضد في العينة ، المعروف أيضًا باسم التحليل ، بواسطة الأجسام المضادة. يحتوي كل من الساندويتش و ELISAs التنافسي على لوحات مطلية بالأجسام المضادة. في شطيرة ELISA ، تكون اللوحة مغطاة بجسم مضاد للالتقاط الذي يربط التحليلة والجسم المضاد للكشف المترافق الثاني يربط التحليل ويعدل تفاعل الكشف. يستخدم ELISA التنافسي اتحادًا ، وهو مستضد تحليلي مقترن بكاشف كشف ، والذي يتنافس مع المادة التحليلية للربط. كلما تم احتواء المزيد من التحليلات في العينة ، كلما قل ارتباط الاتحاد وانخفضت الإشارة التي يتوسطها الإنزيم.

على الرغم من طبيعتها المختلفة وتسمياتها اعتمادًا على نوع ELISA المستخدم ، يمكن تصنيف الضوابط إلى مجموعتين: الضوابط السلبية والإيجابية.

الضوابط السلبية تتميز بغياب الكواشف أو المكونات الضرورية لاكتشاف المادة التحليلية بنجاح. تهدف الضوابط السلبية عمومًا إلى تقدير مستوى الارتباط غير المحدد بالإضافة إلى تحديد مصدره. يتم استخدام عناصر التحكم السلبية التالية بشكل شائع في ELISA:

تصحيح الطول الموجي هو تصحيح شائع للإشارة داخل الجهاز يمكن استخدامه بشكل مستقل عن نوع ELISA المستخدم. لتصحيح الطول الموجي ، تتم قراءة إشارة الكثافة البصرية (O.D.) للركيزة عند طولها الموجي المحدد ويتم تصحيحها ضد الامتصاص غير المحدد عند طول الموجة خارج طيف الركيزة. يسمح هذا بتصحيح التغييرات في امتصاص الخلفية ، والتي يمكن أن تحدث بسبب الأواني البلاستيكية أو التكثيف أو الملوثات لأنها قد تحدث على سبيل المثال في الخلية الكاملة ELISA.

ضوابط فارغة هي أكثر أنواع التحكم السلبي شيوعًا ، لكنها ربما تكون المصطلحات الأكثر استخدامًا بشكل غير متسق. هناك بعض الغموض حول ماهية عنصر التحكم الفارغ بالضبط. تعد الآبار الفارغة الفارغة التي لا تحتوي على أي سائل أو لم تره في أي وقت من الأشكال الشائعة للضوابط الفارغة ، ولكن ربما تكون شائعة مثل الفراغات العازلة للمقايسة ، أي الآبار المملوءة فقط بمخزن ELISA المؤقت. تهدف الفراغات إلى تحليل مساهمة امتصاص الخلفية للبلاستيك و / أو المخزن المؤقت في الإشارة. غالبًا ما يتم حذفها لصالح تصحيح الطول الموجي و / أو ضوابط S0 أو NSB (انظر أدناه). يجب تشغيل بعض أشكال التحكم الفارغ أو الخلفية جنبًا إلى جنب مع المعايير والعينات في كل اختبار ، بغض النظر عن ELISA الراسخ.

غالبًا ما يشار إلى شكل آخر من أشكال الفراغ يكون مفيدًا بشكل خاص في استكشاف أخطاء إشارة الخلفية غير المتوقعة وإصلاحها باسم a كروموجين فارغ. هنا ، يتم إضافة محلول الركيزة والإيقاف فقط إلى البئر. يهدف عنصر التحكم هذا إلى التحقق من مساهمة الركيزة في الخلفية ، على سبيل المثال بسبب الركيزة القديمة جدا.

S0 هو عنصر تحكم سلبي يحتوي على معيار صفري (أو أي شكل آخر من أشكال التحليل ، مثل العينة) ، ولكن تتم إضافة جميع المكونات الأخرى لتفاعل اللون الناجح. في ELISAs المباشر والساندويتش ، سيؤدي ذلك إلى الحد الأدنى من تطوير اللون لتحديد الخلفية القصوى في غياب التحليل. غالبًا ما تكون الخلفية الطفيفة التي يتم ملاحظتها ناتجة عن ارتباط غير محدد للجسم المضاد للكشف ويمكن استخدامه للتحكم في المصادر ذات الخلفية العالية غير المحددة ووسائل التخلص منها (على سبيل المثال ، خطوات الغسيل ، تخفيف الجسم المضاد ، إلخ). يمكن استخدام قيمة S0 التي تم الحصول عليها لتصحيح القيمة لجميع القيم الأخرى التي تم الحصول عليها (المعروفة باسم "الطمس") ، ولكنها تستخدم بشكل أكثر شيوعًا لتحديد القيمة الصفرية للمنحنى القياسي.

ضوابط الربط غير المحدد (NSB) في ELISAs التنافسية تفي بنفس وظيفة S0 في شطيرة ELISAs - لتحديد الخلفية التي تحدث بسبب الارتباط غير المحدد للإنزيم المترافق. كما هو الحال في ELISAs التنافسي ، يتم ربط الإنزيم بالتحليل بدلاً من الجسم المضاد للكشف ، يحتاج الارتباط غير المحدد إلى التحليل في حالة عدم وجود جسم مضاد وعينة أو مادة تحليلية قياسية. غالبًا ما تُستخدم الخلفية غير المحددة التي تم الحصول عليها لحساب القيم المصححة NSB لجميع عناصر التحكم والعينات والمعايير الأخرى. يمكن أن يكون علاوة على ذلك أداة مفيدة لتحديد مصدر الإشارات العالية التعسفية. لاختبار الخلفية غير المحددة التي يسببها الجسم المضاد للقبض نفسه ، يمكن أن تكون الحضانة المتسلسلة لجسم مضاد للقبض مع تركيز عالٍ من التحاليل القياسية ، متبوعة بحضانة لاحقة مع مقترن ، بدلاً من الحضانة التنافسية للمعيار والمقارن ، وسيلة مفيدة لتحديد المشكلات مع التقاط الجسم المضاد.

التحكم الثانوي / الكشف عن الأجسام المضادة هي الضوابط المستخدمة في الغالب في ELISAs المباشر والساندويتش. والغرض منها هو اختبار الارتباط غير المحدد بالجسم المضاد الثانوي أو الكشف في حالة عدم وجود الجسم المضاد الأولي أو الالتقاط ، على التوالي. بينما يمكن حذف عناصر التحكم هذه بشكل عام في عمليات تشغيل ELISA الروتينية ، فقد تكون قادرة على توفير رؤية قيمة عند استكشاف أخطاء مصادر الخلفية العالية أو حالة تحلل مكونات الفحص.

التحكم السلبي في المصفوفة هي وسيلة لتحديد الإشارة الناشئة عن تأثيرات المصفوفة المستقلة عن التحليل. مصفوفة العينة هي مجمل جميع المكونات الموجودة في العينة ، باستثناء المادة التحليلية. يمكن أن تحتوي المصفوفات المعقدة بشكل خاص ، مثل عينات الدم ، على مجموعة متنوعة من المكونات التي قد تتداخل مع إشارة الفحص بطريقة أو بأخرى. يمكن أن يؤدي الارتباط غير المحدد بمكونات المصفوفة إلى إشارات إيجابية خاطئة ، بالإضافة إلى إشارات سلبية خاطئة. يمكن التحكم في الإشارات الإيجابية الزائفة عن طريق قياس عنصر تحكم سلبي في المصفوفة ، أي مصفوفة عينة مضمونة لعدم احتوائها على أي تحليل. ومع ذلك ، على الرغم من كونه عنصر تحكم مفيد ، غالبًا ما يكون من الصعب جدًا الحصول على مصفوفات عينة مضمونة لتكون خالية من التحليلات.

الضوابط الإيجابية تهدف إلى اختبار وظائف المقايسة وكذلك جدواها لاستخدامها مع نوع العينة ومصفوفة العينة. تُستخدم الضوابط الإيجابية التالية بشكل شائع في ELISA:

ب 0 هي فئة محددة من الضوابط القياسية الصفرية في ELISA التنافسية. على الرغم من أنه يشبه S0 تقنيًا ، أي عدم وجود أي معيار أو تحليل عينة ، فإنه - على عكس S0 في شطيرة ELISAs - يؤدي إلى أقصى قدر من تطوير اللون ، حيث لا يواجه التحليل المترافق منافسة ملزمة وسيتم تحقيق أقصى ارتباط متقارن . لذلك فإن B0 يتناقض مع S0 وهو عنصر تحكم إيجابي مفيد لتحديد الحد الأقصى لتطور اللون في ELISA التنافسية وللتحكم في الوظائف الكاملة لجميع مكونات الفحص. سينتج بشكل عام قيم أعلى من الحد الأقصى لنطاق الكشف للمقايسة. يمكن استخدام قيم B0 للإشارة إلى الارتباط النسبي في عينة أو معيار إلى أقصى ارتباط ممكن وحتى استخدامها لتحليل قراءة المقايسة. يشار إلى هذه النسبة بشكل عام كنسبة مئوية من الربط ،٪ B ، أو B / B0. لذلك يوصى بتضمين عناصر تحكم B0 في كل تجربة اختبار لـ ELISA التنافسية ، حتى لو تم تأسيس مجموعة الفحص والعينة / المصفوفة جيدًا.

ضوابط النشاط الكلي (TA) يعمل على ضمان النشاط الأنزيمي للجسم المضاد المترافق بالإنزيم أو البيوتين أو الحليلة. كما أنها أداة مفيدة لتحليل اضمحلال النشاط الأنزيمي من خلال إجراءات الحضانة طويلة المقايسة. لاختبار النشاط الأنزيمي ، يتم تحضين الركيزة والإنزيم المتقارن معًا أثناء وقت تطوير الفحص ويتم إيقاف تفاعل اللون مع توقف العازلة. TA بشكل عام هو عنصر تحكم نوعي بحت.

المعايير لا يتم تصورها عادة كعنصر تحكم إيجابي ، ولكن الكميات المعروفة من المادة التحليلية المضافة إلى المخزن المؤقت للمقايسة هي على الأرجح الشكل الأكثر نقاءً لعنصر تحكم إيجابي. المعايير ليست فقط أداة مفيدة لضمان وظائف المقايسة ، بل هي جزء لا غنى عنه من أي ELISA الكمي بالكامل. يتم استخدام سلسلة من التركيزات المختلفة المعروفة للتحليل ، والتي يتم الحصول عليها بشكل متكرر عن طريق التخفيف التسلسلي ، لتوليد المنحنى القياسي للمقايسة. يعد المنحنى المعياري الدقيق مكونًا أساسيًا لكل عملية اختبار لتحديد كمية المادة التحليلية الموجودة في العينات غير المعروفة. بينما يتم تزويد المعيار عمومًا بمقايسة مجموعات الفحص المتاحة تجاريًا ، إلا أنه يمكن أن يشكل بعض التحدي إلى حد ما لمصدر معايير تحليلية مناسبة لـ ELISAs حسب الطلب.


الشكل 2. منحنيات قياسية لساندوتش (يسار) و ELISA تنافسية (يمين).

ضوابط البروتين الداخلي تستخدم فقط أثناء تطوير ELISAs لأهداف البروتين. إذا تم استخدام البروتينات المؤتلفة كمعايير ، فقد يكون من الضروري تأكيد أن الارتباط والكشف عن البروتين الداخلي من خلال مكونات الجسم المضاد للمقايسة يتبعان نفس ديناميكيات البروتينات المؤتلفة. لهذا الغرض ، يتم استخدام الكميات المعروفة من البروتين الداخلي كعنصر تحكم إيجابي.

ضوابط المصفوفة الإيجابية هي عينات من نفس المصفوفة مثل العينات غير المعروفة والمعروف أنها تحتوي على مادة تحليلية ، من الناحية المثالية بكميات معروفة. يمكن أن يعمل هذا النوع من عناصر التحكم كعنصر تحكم إيجابي عام للمقايسة ، فضلاً عن عنصر تحكم في تداخل المصفوفة. على النقيض من ضوابط المصفوفة السلبية ، يمكن التحكم في الضوابط الإيجابية للكميات المعروفة لكل من تداخل المصفوفة السلبي الخاطئ والإيجابي الخاطئ.

عينات مصفوفة مسننة غالبًا ما تكون بديلاً مفضلاً عن عناصر تحكم المصفوفة الإيجابية الأصلية. هنا ، عينة يفضل أن تحتوي على القليل من التحليل أو لا تحتوي على أي مادة تحليلية ، يتم إمدادها بكميات معروفة من المادة التحليلية في عملية تسمى "spiking". لا تعد عينات المصفوفة المسننة مفيدة جدًا فقط كعناصر تحكم إيجابية مع قدرتها على ربط القيم المقاسة بالقيم المتوقعة ، بل إنها تخدم العديد من الأغراض الإضافية في التحقق من صحة ELISA. إذا تم استخراج عينات المصفوفة قبل تحليل ELISA ، مما يعني أنه يتم تنقية العينة لإثراء المادة التحليلية و / أو القضاء على محتويات المصفوفة المتداخلة ، فإن عينات المصفوفة المسننة هي وسيلة مناسبة تمامًا لتحليل كفاءة الاستخراج. نظرًا لأن كمية الإدخال الخاصة بالتحليل قبل الاستخراج معروفة ، فإن الكميات المستردة والمكتشفة من المادة التحليلية بعد الاستخراج وتحليل ELISA تسمح بتقييم كفاءة بروتوكول الاستخراج وتحسينه. من الناحية المثالية ، تقترب بروتوكولات الاستخراج من كفاءة 100٪ ، ولكن في بعض الأحيان قد لا يكون من الممكن تحقيق هذه الكفاءة. في هذه الحالات ، تسمح عينات المصفوفة المسننة بتقريب المحتوى التحليلي الأصلي لعينات غير معروفة أيضًا. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون عينات المصفوفة المسننة مفيدة في تحليل خطي التخفيف.

التخفيفات عينة المصفوفة التسلسلية توفر أداة قيمة لتحليل تداخل المصفوفة وتحديد عامل التخفيف الذي يكون فيه تداخل المصفوفة ضئيلًا. لهذا الغرض ، يتم تخفيف العينة المختارة في مصفوفة بشكل متسلسل وقياسها بواسطة تحليل ELISA. توضح القيم التي تم الحصول عليها في علاقة خطية مع عامل التخفيف عدم وجود تداخل مصفوفة. يجب إجراء الاختبارات فقط باستخدام تخفيفات عينة المصفوفة المعروف أنها تندرج في نطاق محدد مسبقًا مع خطي تم إثباته للتخفيف ، ويجب التحقق من صحة خطية التخفيفات لكل مجموعة من مقايسة ELISA ومصفوفة العينة والتحليل بشكل فردي كجزء من التحقق الروتيني من التحقق من صحة و إجراءات التحسين. يمكن إنشاء تخفيفات عينة المصفوفة التسلسلية من عينات المصفوفة المسننة ، ولكن يوصى عمومًا باستخدام مجموعة متنوعة من العينات ليتم اختبارها وتجميعها وخلطها في عينة واحدة مجمعة وتوليد التخفيفات التسلسلية من هذه العينة المجمعة. ستعمل هذه الطريقة على متوسط ​​تداخل المصفوفة عبر مجموعة متنوعة من العينات.


يوصى بقيم أقصى OD في تحسين ELISA. ما السبب؟ - (أبريل / 23/2012)

تحياتي للجميع ، يا Lore Keepers & # 33 هذه أول مشاركة لي. أنا طالبة دراسات عليا في الأرجنتين.
أقوم بتحسين ELISA تنافسية غير مباشرة لتحديد جزيء صغير في الأنسجة النباتية. قراءة دليل ELISA الخاص بـ Crowther (تم تحريره بفظاعة) لقد وجدت أنه عند تحسين ELISA التنافسي ، فإن تركيز المستضد الموصى به لتغليف الألواح هو الذي ينتج عنه أقصى OD (هضبة) من 1-1.5 لزيادة الجسم المضاد. وتخفيف الجسم المضاد الذي ينتج عنه 70٪ من أقصى OD (حيث أن ELISA التنافسية محدودة الكاشف).
سؤالي هو: لماذا لا توجد قيم أعلى للهضبة OD على سبيل المثال 2.0 (بشرط أن يكون لدينا نفس الخلفية OD)؟
أنا أستخدم قارئ لوحة Tecan Sunrise.
أيه أفكار؟ شكرا مقدما & # 33

تعتبر النصيحة التي تلقيتها نقطة انطلاق جيدة. تعتبر مشكلة OD تعسفية حقًا ، وتعتمد بشكل أكبر على أداء قارئ اللوحة. تميل قارئات الألواح الطيفية التي أعرفها إلى اكتساب بعض العشوائية فوق 3 وحدات OD مع TMB المحمض عند 450-650 نانومتر. المهم هو معرفة نطاق الفحص المستهدف مسبقًا وتكييف الظروف للحصول على دقة ودقة مقبولة على نطاق التركيز هذا. مع تحسين كل شيء آخر ، غالبًا ما تكون 20-80٪ من استجابة الجرعة حيثما يمكن العثور على P + A مقبول.

أظن أن الفحص الخاص بك المحسن عند وحدة OD 1 سيكون له قوة إحصائية أقل قليلاً من واحد محسّن في وحدتين.

شكرًا جزيلاً على الرد السريع & # 33 ، كنت أظن أنه يمكن أن يكون له علاقة بقيود الآلات ولكن لم أكن متأكدًا. قارئنا ، وفقًا لمواصفاته ، إذا كنت أتذكر جيدًا ، يكون أيضًا أكثر دقة ودقة حتى 2 OD مقارنة بنطاق 2-3 OD.
في أحد اختبارات رقعة التحسين التي أجريتها (الشكل أدناه) ، عندما أقوم بتغطية الألواح بمزيد من المستضد (الخط الأخضر ، تخفيف AB الأساسي في x المحور) حصلت على هضبة أعلى ومنحدر أكثر انحدارًا مع نفس الخلفية تقريبًا أو أقل ، لذلك اعتقدت أنه سيكون من الأفضل. على الرغم من أن القيم الرسومية هي مجرد وسائل لعينات مكررة ، لذلك قد يتم التشكيك في افتراضاتي. لكن ، كأول نهج ، اعتقدت أنه يمكن أن يكون مفيدًا. إذا كنت تريد أن تشير إلى شيء آخر ، فكن ضيفي & # 33
شكرًا جزيلاً مرة أخرى & # 33 It & # 180s متحمسة حقًا للعثور على أشخاص يرغبون في مشاركة معارفهم.
بيانات: صورة / pngbase64، iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAgoAAAG / CAIAAAC2TGhZAAAgAElEQVR4nO2dXXajvBZEPS4PyOPIEDyaPPc8PBj6wTHGILCAkk6B9l691v1up1MpY8OO + JEuHQAAwIRLdAEAAHAEPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQDAkbhAMcabOuQNBgDYxvQoBoVgQwPAkUAP1aiwoR / 362vocr0 / cr8EAJAAPVSj / رطل + vV1uv5P // PalZzk + BwDwCYeFalTd0I / 7deqA6ZeGl0r + AcDZWXUYCdDD4DTH54mO4Rfmjm3d437tv + f3Ns55 / Y3m / MlC2oYfVHFDJwcIi18Sfg7WfgSrpVHsTGm2xbRpscXyDws5N + dkMfzt9XG // h2tfm9DJ3z + vze / t8EheWiK11eff9H / xx4W0jb9oEp6mNt0y19CD4FptsWc02yLadMOpIfu849AD133e7veH / 3 / fPyrxNXV6 / 3X / بي / طن + v1OhhsDL7l83fkx / 3A / 8vXYf16v9 / + vvU1avn8ebNpi19aoNKl6Zk6C1 / qOvQQmmZbzDnNtpg2zUgPEwGMZfDtbxJ / pnzq4fn / EqfKx8J4HYj7vx / 8LjwJmfyMv + 95 / df7e9 + // 49 + 4Gza4pcWKK6Hwbm23na9fadf + iyHHuLSbIs5p9kW06a56OHbgb6QHjJHDx8XLKbHt9 / b9f5YGj28b9sZ / bjxf / 0OxhSHGz1MmWzXGdBDYJptMec022LaNBc95PxL + cml94E279pD9zF66I98f5FzlwTW6GH4gw557WEb6CEwzbaYc5ptMW3agfQguzSdHgZk3bk0PIr3p0wmfzO5jLBBD4m04T + eO00zC3oITqPYmdJsi2nTjqIHyD9Vk8R6Q6OHwDTbYs5ptsW0aeihEaw3NHoITLMt5pxmW0ybhh4awXpDo4fANNtizmm2xbRp6KERrDc0egh Msy3mnGZbTJuGHhrBekOjh8A022LOabbFtGnooRGsNzR6CEyzLeacZltMm4YeGqHChv66qMPsU3zoITDNtphzmm0xbRp6aITyG3p5UYf + efDUt6KHwDTbYs5ptsW0aUfRg8ljcWYTeq / 4WVU9PJkL6nG // 07 / evhe / gOAs7PqMLJSD + NpNVb9rD9OMKF3aj7Zr1TUw + w5pNkZBBk9BKbZFnNOsy2mTYstFqyHY07oPf3ROVTSw8J0VehBFaVNsy3mnGZbTJtmooeM2VcTetgwYesJJvSe / ugcKl2aXmyDHmS0UMw5zbaYNs1ED12ZKb0THH9C7 + mPnt2 + A4rrYWG9hxfoQUYLxZzTbItp03z08PVfTllf8CQTeo9 / dAYht4ix3kORKG2abTHnNNti2rSj6EHGqSb0XnEJ3PoOYsnnQPC7w4TT7Gl1otpJsy2mTWtODweGCb2 / hfx0P88 / 6CEkqp0022LaNPTQCNYbGj0EptkWc06zLaZNQw + NYL2hS + JH + R87M0 + zp9WJaifNtpg2DT00gvWGLnHtoVfFHkmcZk + rE9VOmm0xbRp6aATrDV3ozqWhIbZJ4jR7Wp2odtJsi2nT0EMjWG / ooje27pGEZPfglqrzpdkW06ahh0aw3tAVnnsYSSLTEyo9cM38ZGm2xbRpR9GD5pm47kgztr5 + SKLMhh9UQQ9L6z0sN66ghydrJbFz9xhdJ0cPp0mzLaZNO5Aeuu5n + GfjjnaUGVu7 / pA6abLpB5XXw8J6D98aV9NDT6Yk1n6gp / qZ6oFbqk6QZltMm9a0HoxnbJ1bImHpBy1S9eTSqPVc4 + Fg8F8E00O5JGQUOBr27vlZAIdm1WFkcIj / Wf4zo4cv3 / X1yGU7Y2u67viv8qdcCl3v4Wvj + qOHIckzTgvnMZd9kFNs / 023G15mhah20myLadNii4XrwXbG1nTdcTe / 0UPyvNzXCsxrF66Jk7HdR33 XHmxnbE3UHdRzvPawsN6D37WHBeauFpR4hGJz7GkOAQdNsy2mTTuQHqasL3ikGVvH35yYsdXpzqXl9R5M7lzKJKmHcsWi7riVR7WTZltMm3YUPcARZ2w96noPgl9DJnwttsoQpzkEHDTNtpg2DT00gvWGdtNDibTMqExJnOYQcNA022LaNPTQCNYbGj0MyTnXdJpDwEHTbItp09BDI1hvaPQwZVkSpzkEHDTNtpg2DT00gvWGRg9zzBkivFjjabbFtGnooRGsNzR6WGY0RUfla + akFY1yTkMPjWC9odHDV + ae1wsv1maabTFtWnN6OMyMrdvnP02CHoLTjvhABmkVopzTjqKHS4r1BY8zY + ثالث أكسيد اليورانيوم U + + + ToIfgtHJ68Jmfo50022LatAPpYbQXCPRgPWPrXGXvOZdmOr2HQsmXiR4ymf5 tDwZVOUn7NpJsy2mTfPRw / KHPKmHLbvGwWZs3TL / aZIqephZoWI4GVPSHuhBlfZ1lxjuFYLBeHaxk6XZFtOmmejh60e6kB7MZ2zdNv9pkgp6yFmh4uOE2HCb / oMC5O9UvAVQgVUHlOCTS9Yztm6f / zRJtZNLyRHN26 + 3W2KYxOihWtqCHmKLHSvNtpg2LbbYKj1MWV / wMDO27pn / NEmsHj6 + jB5M0tCDQ5Rz2lH0AEeZsXVmhYq / v0sPeNBDSBrXHhyinNPQQyOE6GE63kkPzNBDYNozSvIIRWf8MrVptsW0aeihEUI29FHXeyiRZl5s82MTyTQVtmm2xbRp6KERrDc0eghM66PQQ0iUcxp6aATrDY0eAtOGUfsNYfsytWm2xbRp6KERrDc0eghMm + phjyFsX6Y2zbaYNs22GGhBD8FpRymGHipHOafZFgMt6CE47UDF9hjC9mVq02yLadNsi4EW9BCcdqBie04x2b5MbZptMW2abTHQgh6C045VDD1Ui3JOsy0GWtBDcNrhim0zhO3L1KbZFtOm2RYDLdX0kJ5FdnmWKPQQmLash7WGsH2 Z2jTbYto022KgpYoeZtZ7 + DrHLHoITFuIQg8VopzTbIuBlgp6mF3v4T1N6 + fQYjgf3D + w5GmI6BZwEsofhWAL1U4uzUzo / RxYzEzBxOghMG05au0pJtuXqU2zLaZNsy0GWiL18F7ZaGaNI / QQmPY1Cj0UjXJOsy0GWoL1sLz8KXoITMuJyjeE7cvUptkW06bZFgMtIXroJ / QeLCbKeg9mafl6yDGE7cvUptkW06bZFgMtIc89sN5DkShtWmYUeigU5ZxmWwy0hOghF / QQmJYflWMI25epTbMtpk2zLQZa0ENw2gmK5Zxisn2Z2jTbYto022KgBT0Ep52jGHqQRzmn2RYDLeghOO00xZYNYfsytWm2xbRptsVAC3oITjtNseVTTLYvU5tmW0ybZlsMtJxfD5dP9gd2bexpG6LQg20xbZptMdDShB667uf5Bz2UjpozhO3L1KbZFtOm2RYDLehhCy3saXv0MDWE7cvUptkW06bZFgMt1fSQmDbj / cz0zJoP6CEwbXMUejh9mm0x0FJFD3PrPbx53G + l1nv4vPDw9MReWtjT9kRNDWH7MrVptsW0abbFQEsFPcyv9 / BiNMlGufUe + mGENhZG9KeYoovAMSh / FIItVDu5NK + H9GytXVfqxlbBAEL4gdbuGz7FRgMI25epTbMtpk2zLQZa4vWwMD9fsece9hqihT1tf9TQELYvU5tmW0ybZlsMtITrYWn21sJ62G6IFvY0lR6ehrB9mdo022LaNNtioCVEDwMlLF2SKPrU9C5DtLCnSaLQwynTbIuBlmp6GGKy3sN2Q7Swp6mi5I + sdw1sNPM022KgJUQPuZQ / oGw0RAt7mlAP / Vkmw + dOtGm2xbRptsVAS + N66LYZooU9DT3ERjmn2RYDLeih22CIFvY09BAb5ZxmWwy0oIcn6wzRwp5W4toDejhHmm0x0IIeetBDqagubz3qfBrZaLZptsVAC3oYkmuIFvY0eTGhIdrZaJ5ptsVAC3o YknuKqYU9DT3ERjmn2RYDLehhRJYhWtjT0ENslHOabTHQUk0P6Yn33ks + pJ6dDnqQ6rshWtjTShRTGaKpjWaYZlsMtFTRw9x6DwNlDO1RbkLvTJj3uxDM8g1JahyFYD0V9DC73sPjfr3dbn6jhydLYwjhB1q7b5gXY / RwjjTbYqCl2smlhB5 + b28rJKfmi56lZ9YQLexphYpJDNHaRnNLsy0GWiL18PFXqWn6ovXQzRmihT0NPcRGOafZFgMtkXoYXnCwHD08QQ / KNPRwgjTbYqAlRA / vkUJ / 51Jyhm8PPXRTQ7Swp5Urtt8QDW40qzTbYqClmh6GmKz3kM / 4FFMLexp6iI1yTrMtBlpC9JCLjR66kSFa2NPQQ2yUc5ptMdCCHvL56bofJh + VpO00RJsbzSfNthhoQQ8ruFwu / TACPexJQw + HTrMtBlrQwwrQgzBtjyGa3WgmabbFQAt6WMFEDz / Tq9YhxUqkoYfYKOc022KgBT2sYLLw2c / Mn9rFSqShh9go5zTbYqAFPUjS5jzx3Ra2e1qFYpsN0fJGc0izLQZa0IM8bVkV76Oh + SLM6CE2yjnNthhoqaaH9HoPv7f + 8Jh4Uu6Yehgx6wnzC93oITbKOc22GGipooe59R66x / 2atkLseg / lWNBDdLUYWAEC / qEHVyroYXa9h677vV2vV9P1Hoqnpe6Dsigmj1pI2zaAMHw35VHOabbFQEu1k0szM7a + tGA8Y2uptJn7oOKLyaMW0tDDEdNsi4GWUD0MMV3voXjaICr3Zqe8tL1U22IbDHGEd / PMabbFQEvw6KFXQoOjh1TUXkMc8RCAHg6XZlsMtITo4a2F / s4l7 / UeCqalorZL4oiHAPRwuDTbYqClmh6GHG69h4JpM1EbDXHQQ8BaQxzt3Txbmm0x0BKih1wa1sOT1ZI46CEAPRwrzbYYaEEPwWnfotYZ4qCHAPRwrDTbYqAFPQSn5UXlSuK4h4BVhjj4u3n4NNtioAU9BKd lR2UZ4riHAPRwoDTbYqAFPQSnrYz6IonjHgLQw4HSbIuBFvQQnLY + askQhz4E5BviRO / mIdNsi4EW9BCctjUqLQmDYtvT0MNR0myLgRb0EJy2IyphCI9iG9PQw1HSbIuBlmp6SK / 38CQ9rzd6yOLnOeGr88pC + WmZhjjvu3mMNNtioKWKHmbXe3h / daiHE6 / 3UIIzLR3B8g9tUuMoBOupoIeF9R5eA4eZWTYYPWSSWjoi60bY0sU2pOUMIM79bvqn2RYDLdVOLs0sB / QcUqCHfXzTw9yf2bTAU1XowT / NthhoidTD434dHoaaX + 9hF / MH9ExV / CQFgx6iopzTbIuBltjRwwtGDwFppnroMgzBuxmbZlsMtIToYWID9GCUhh4sopzTbIuBlmp6GMJ6D0WiVGnht8miB / M022KgJUQPuaCHwLRX1NJF7PVpuSwbwn6jnTzNthhoQQ / BafbFfiSGQA9nSrMtBlrQQ3DaEYoJDIEezpRmWwy0oIfgtIMU22uIDcUWDHGQjXbaNNtioAU9BKcdpxh6qBrlnGZbDLSgh + C0QxXbbgj0cKY022KgBT0Epx2q2PZTTNuKzRniUBvthGm2xUALeghOO1qxjYZAD2dKsy0GWqrpIb3ew99U3zOTfaOHwLT5KPRQI8o5zbYYaKmih7n1Ht7K + JAH6z2Y8zREnZ / FChAtUOMoBOupoIfF9R7 + SI8tGD0Epi1GrT7FtLlYcgBxzI12njTbYqBlzfF3NAH3wgJw6W9O / + Pn0IIp + dzSvkWtMwR6OFOabTHQsuL4 + 3tLH8TzWB49pJebRg + BaRlRKwyxp9jUEEfeaGdIsy0GWtbpIX + wMCGlh8HMrejBLS0vCj2UinJOsy0GWtYcf3f5Ib3eQ3 / nUjIZPQSmZUdlGQI9nCnNthhoqXbtYQjrPRSJ0qat1MMXQ + wsNjLE8TfasdNsi4GWatcetoAeAtPWRH03BHo4U5ptMdBS7drDFtBDYNrKqLJ66D4 NcZaNdtQ022KgZeXJpbrDB / QQmLY + askQ6OFMabbFQEv + 8Tdx5WHrtYdc0ENg2lY9pA2BHs6UZlsMtMiOvyVAD4Fpm6JmDSEp1hviXBvteGm2xUALeghOO12xtCHQw5nSbIuBlpXXHg54cmnUeH9g18aetiMKPZw8zbYYaFl359IRb2x9SuH1Bz3UiRobQlWsn8BVkvbEZqMdJs22GGipdmNr8rsH45GUedBDYJpCD29DoIczpdkWAy1rDpeb / fB9vYePbO16DyM97A + EHHpDaGNZ / uGUbDmqQHkq3Nias95D + sslrj1Ixg / CD7R23zAr9h5ACIvNLSG3GbONdoA022KgpdqdS4t6mBmXyO9c6ocRkjQJtnuaKOrPEKpi3GjgkGZbDLTE6 + H3NjsIKXFjq8QQLexpKj1oD + IXY + U5evjpftBDVJptMdASq4fH / bp0fqrQcw + DSxGCtJ3Y7mnC3 / f76xDo4RxptsVAS4ge / ib0fi / 2MHPvUiE9dLsN0cKehh5io5zTbIuBlrwdLHlZevttri7rPWw2RAt7mq0euPYQnmZbDLRk7WDpB + LKPyZXWg / dVkO0sKeVuJgsCey67t / rDldVmiRHG + WcZlsMtOTssXMTeRdfAKKCHrpNhmhhTytQ7Gc62cbmNPQQmGZbDLRk6uG0o4fXD1oniRb2NPQQG + WcZlsMtGQefwMWe + jqzti6yhAt7GllimkM8UxTGcJ + o9ml2RYDLdXuXNpCTT28fmKWIVrY09BDbJRzmm0x0IIepj / 0uyFa2NOKFRMYAj3EptkWAy1rL00PnlUoP7t3iB66DEO0sKf566ETGeIIG80rzbYYaFmlh89bmOZuaNIRpYfumyFa2NNKFttrCPQQm2ZbDLSs0sPoTtZVN7Yu / OPZLwXqoVu8WN3CnoYeYqOc02yLgZZMPfzdqPTxuHP + 6GFuvYeZLw3vjvoXytAQsU1OhmopCJZ / OAc5RxGoz4pfz / + O5P1AInfosLD ew5elIGJHD4Ma4zGE8AOt3TeOU2zXAGKYtn8AcZyN5pJmWwy0VLtzaWG9B3c9dBNDtLCnlS + 23RDoITbNthho2XT8 / TIP99z3HFgP3Z8hrOeD06ahh9go5zTbYqBlxbWHFPmSOLweur + LIu9lq / cHdsZ7WpViGw0xSttpiKNttPg022KgJfMY97zu8DqI7x09jCb0Pqoe3Jat1qahh9go5zTbYqBl1RHu9 / a8NL1FD585Hus9rGWqB6t1SbVptYptMQR6iE2zLQZa1h / b3re5FsdND914ORqvdUm1aQfSQ7fPEAfcaMFptsVAS7U7l7ZgqIdp2kgSgSsLadMqFlttCPQQm2ZbDLSgB03aZknY7mnoITbKOc22GGhBD + K0tZKw3dPqFltniGTaZkMcdqOFpdkWAy3ooUha / mDCdk9DD7FRzmm2xUALeiiYliMJ2z2terEVhkAPsWm2xUALeqiRtiAJ2z3tcHrothriyBstJs22GGjJP / 4OFgLacmNretbuV2j6OYjT6OHJZDBhPUVHxBbLNQR6iE2zLQZa8o5Kv7fxEfxxv + YrYm5C79 / أن / 7XlCBOpocnyQfr0EPXdejhKGm2xUBLzlFpZmGH3PUeZmftHgR8jC2Gv1P / OylTPUQ3smD / OhCsAHFEMo5CEECOHuZWc1u1WlxaD4NZnBJRpxw99CSn6HAoJo9ak5Y1gFhI2zCAOP5Gq51mWwy0VBg99P86d / TwLnd + PSSm6AgvJo9amfbdEOghNs22GGipcu3h7xu49vAlymoGJ / SwAduPmTbNthhoqXbnUnpC76buXMqJ2jnN31kOAV8MsZy21hBn2Wj10myLgRbZ8XcNR53Qu0RaMmqzJM5yCEAP1mm2xUBLiB5yaVYPTzZI4kSHgCVDoIfYNNtioCX7 + DteUbTR9R7kaV + jVkniRIeA7XroVhriRButUpptMdBS7dL0FtBDT / 0J / gy22Kwh0ENsmm0x0JJz / JXc2LoF9DCi5gR / BlsMPZim2RYDLTnHX8ljcVtAD0nqTPDnscXShshJyzfE6TZa8TTbYqAFPQSnbY4aGcJ5dr8daejBMc22GGhBD8FpO6MOMbvfvrSEIdBDbJptMdCSqYc50EN8FHqY / 84sQ1i9m4dIsy0GWmTH3wXmH41 + 3y2bvMiNHjKZzu63H6ctNjYEeohNsy0GWsrrYX5ipcf92g8 / kieq0EMm5rP77U5DD15ptsVAS3E9LEzLOrwzduiO4XHuH6xneNU6uouGzetAsPzDISh9FIJt1NDD / KIO75NLt1tiHiZGD3vSds7 / arbFPgYQ + Wk5A4hDvJtWabbFQEvk6GHmn71BDzvT9sz / 6rfF3oZAD7FptsVAS + S1h4Ev0gs + oAdJ2jZJ + G0x9OCSZlsMtITcuTRd7yE9rEAPwrS1krDcYn + GWJX21RBHfDdj02yLgZYaepjAeg9FonLSQiZ / 1aWhB4s022KgJUQPuaCHQmmVJ3 + Vpv3dwrTmG9CDOM22GGhBD8FpUcVqTv4qTBs / 35HHsiFO8G5WTrMtBlrQQ3BabLE6k78K0y6Xy + sU0w96iEqzLQZa0ENwmkOxpCEcik1BDw5ptsVAC3oITvMp9jlr0 + oTOOWKDdmmh27REKd8N4um2RYDLeghOM2qmP / 04JvVhR4aeZkgBD0EpxkWO8j8rz9zS40mQQ + NvEwQgh6C0wyLTfVgOf / rOj1084Y497tZIs22GGipoYf59R6WvtShh6C0uenB / Sb40wwgzv1ulkizLQZayuthec6luS89y6GHuLRR1FQSq94c9HCmNNtioKW4HpZmbO2 / 9vkV1ntwZiqJwDJr14Fg + QdPSh + FYBs19DC / 3sPr7NLMFEyMHgLTvkatGkwUe5mCAUQL76Y2zbYYaIkcPbwXEx0uKzoshx7i0jKjMk86lXyZKwyBHtyi5GkgJPLaw9eVgtBDYNraqDlJyJ + wm3TbO4Bo4d3UptkWAy0hdy71E3oPFhNlvQeztM1RE09 UeMhu1wDCYaMdK822GGipoYcJrPdQJEqbtjMKPZw4zbYYaAnRQy7oITBNFYUezpdmWwy0oIfgtNMXqzXB33ZDGG408zTbYqAFPQSntVNMMjlHnzb5O / RQL822GGhBD8FpTRVTGWKmW64h0INPlDwNhKCH4LTWipWc4G / jAMJ / o7ml2RYDLeghOK3BYiXnf90ygDjERrNKsy0GWtBDcFqbxXYaAj3EptkWAy3oITitzWI7TzEtdlttiKNsNJ8022KgpYYe5hZ1eD8zPbPmA3oITCtdrNjqEeiheJptMdBSXg / fFnXouq7rHvcb6z14pVUottkQ37plGQI9OETJ00BIcT18nXevm0yywXoP7VBi0Yj8RSBY / sGE0kch2EYNPSyt99AtWIPRQ2RatWJl1p5bMYA44kaLTbMtBlriRw8L8 / Ohh8C0msXQw7HSbIuBlvBrD0uzt6KHwLTKxVYZIq / bd0NUmQzqhGm2xUBLyJ1LAyXMnHD6K4ce4tJC9JD5hkv0cLlcnqOHn + 4HPURFydNASA09TGC9hyJR2rT6xfINgR5i02yLgZYQPeSCHgLTQoplGiK725Ih0INDlDwNhKCH4DSKjcgxhEoPXHsIj5KngRD0EJxGsSlfDbEm7fsF6n + vByCyM5ei9of4p9kWAy3oITiNYkmWDYEeYtNsi4EW9BCcRrE5RHrovhrimSYxRPhGq5NmWwy0oIfgNIotMGcI9BCbZlsMtKCH4DSKLTB3iml92pIh + rT9hnDYaBXSbIuBFvQQnEaxZZKGQA + xabbFQEsNPcyt99ANl3xIPTuNHgLTfIpNDbEpbdYQw7SdhvDZaEXTbIuBlvJ6WJhzaTBHX3K6PvQQmGZVbGQI9BCbZlsMtBTXw8KMrY / 79Xa7jUYPo4eV / gH8 + / dPsTJE5joQLAJRn9JHIdhGDT3Mrffwe3tbITk1H6OHwDTDYkNDbApIDyBGaXsGEIYbrUSabTHQEj166P9 / APO + 9BCY5ll s30wYWXrodhjCc6PJ02yLgRaXaw + MHtzSPIs9pfD6s + HjkTAEegiMkqeBkJA7l94jhf7OpeQM3 + ghMM2zWB09dFsN4bnR5Gm2xUBLDT1MYL2HIlHaNM9iu / XQTQ2BHgKj5GkgJEQPuaCHwDTPYpcxGzKy9NBtMoTnRpOn2RYDLeghOI1im9NWrT / 6yYch0ENglDwNhKCH4DSK7UkrqoduvSEOsdGsouRpIAQ9BKdRbGfafkOgh8AoeRoIQQ / BaRTbmbb1FFOWHrqVhjjKRvOJkqeBEPQQnEax / Wk7DYEeAqPkaSAEPQSnUUyStskQWXro1hjiWBvNIUqeBkLQQ3AaxVRpmw2BHgKj5GkgpIYeFtZ7eH0p / VX0EJhmW2whba0h8h + gyDTEETdabJQ8DYSU18PCnEvD + fpSoIfANNtiy2n5erhcLq / ZSZ / oISpKngZCiuthYcbWrvu9Xa9X1nsAKZnLQoz08PXfsw5EOUofhWAbNfQwOyvrYMEHZmx1S7Mt9jUt8xTTqtFD9xpALI8hjrvRoqLkaSAkdvQwgPUezNJsi + Wk5RhiMnnT93NH6EEeJU8DIaHXHgZKYPTglmZbLDMt / zL1v3 // FlaiHrFsiKNvtPpR8jQQEnLn0lsL / Z1LrPfglmZbLD8t0xCvtCxDoAdtlDwNhNTQwwTWeygSpU2zLbYqbb0edhniHButZpQ8DYSE6CEX9BCYZltsbdpXQwzSsgyBHmyLgRb0EJxGsdJpX08xfabtMsRpNlq1KHkaCEEPwWkUq5C2bIhJGnqoFyVPAyHoITiNYnXSFgyRSttoiPCXWSfNthhoQQ / BaRSrljZniHk9LBkCPXimgRD0EJxGsZpp2XrothnC5GWWTrMtBlrQQ3AaxSqnTQ0xn / bFEOjBMA2EoIfgNIpVTpueYlpMWzeA8HmZRdNsi4GWGnpYWO / hydy83ughMM222P60kSG + pa0YQFi9zHJptsVAS3k9LK338PoHTKrhl1w Wj48AAA6gSURBVGZbTJI2NESeHrIM4fYyC6XZFgMtxfXwZcbW55cHs2yw3gPUIf + T1hsi + VXWgdhP6aMQbKOGHmbXe + iFMTMJE6OHwDTbYqq05zTerz9fP2lLY4h + AGH4Mkuk2RYDLZGjh8f9Ovz1rdB6D / nrCefTwp5mW0yVtlIPHXooESVPAyEG1x66sqOHj2OAyBAt7Gm2xVRpIz3kfTS + GMLwZZZIsy0GWkLuXJrYAD34pdkWU6VdxuSsHTR7igk9mKSBkBp6mFB1vYexHhSZLexptsUKpWWvLpc2xFg1umIqGvlsgJAQPeQiv / YwVMWezBb2NNti5dL2GOJyuTwHED / dD3oITAMh59fDk / dHcGiIrfkt7Gm2xYqmZX800IMM9GBLe3p4Re + RRAt7mm2x0mnbDDHSw8J61JuL + aTZFgMtrerh9QO2SaKFPc22WJ20jA / Fxymm0TnMhQVHdxZzSLMtBlra1sPrx6yVRAt7mm2xamlrDTGM6kcSJYqFp9kWAy3o4f3D8iXRwp5mW6xm2lpDDKP2G8J2o9kWAy3oYfwjcyTRwp5mW6xyWsbHIa2HbrchbDeabTHQgh7SP3j5qNDCnmZbrH5aviGmUXsMYbvRbIuBlhp6WFjv4fWl6VSuXRc + دينار + 8JFrY02yLRaUtGuJn4bG4zYaw3Wi2xUBLeT0szLn0nqMvNdd3uB5eJYYPXfNkbMtpC4a4XC79dYjpZ6M3xCpJ2G4022Kgpbgevqz38Mf7S6ND8D8PPubkeP13dCkIoP8ITP7 + QW / TbxwaokLPY1H6KATbqKGH + fUeuu51fukQ6z2M9LA / SDP + Rcy2WHhacgyxPHroWTWGsN1otsVAi8noIb3ctLseFBP82e5ptsUc0qbXpCYnHn + 6GQfkGyL8ZVaIkqeBkOBrD / 1fHEUPH4cAxQR / tnuabTGTtOSb / 4r6yVld7qshHF5m6Sh5GggJuXPprYX + zqXkuMJND4m03ZKw3dNsi1m ljd75z6glSeQYwudllouSp4GQGnqYUHW9hydlP9A7JGG7p9kWc0tL3tr2 + uIuQ1i9zEJR8jQQEqKHXA6jhyebJGG7p9kWM0yb3tf2 + fVZSSzf8Or2MktEydNACHpQp62UhO2eZlvMM21RD902Qxi + THmUPA2EoIcyadmSsN3TbIt5pk2eikn + ف ++ SkBcrkWZbDLSgh5JpGZKw3dNsi3mmTZ + p328Iw5cpj5KngRD0UD5tURK2e5ptMee0PurbbwVZhvB / mYZpIAQ91EqbkUR8sfJR7aQNo74NHdPDiH450slNUMpuPlHyNBCCHuqmJe + CtJyiw2WLHSptGrUoiVlDXD5Xri7UzSFKngZC0ENE2vRGSA4Bp0ibi1orCfQADtTQw / x6D4 / 79fXLc + pBudPqoes6 + سفل + DLeYf9py1LwkxoYY6WHnmtU53aKi5GkgpLwestZ7SE / X15Yedk / fpComj2onLScqRxKjE4 / blovY0K1 + lDwNhBTXQ / 6Mrf3XhjvGv / OSuBHy8090QSjI6N1 + / mWOHk65YkTpoxBso4Yeltd76LpZcZx79JCOSnnCohhpBaLmhhGXyyW5esRIEkW71YmSp4GQ + NHD721mpek29dCzyRONHAJs07ZFTd / hOT08mQ4mynUrHSVPAyGh1x66x / 06f76pcT30rPFEI4cA27TNUZN3eKSH8a1N3XpJOLzMCmkgJOTOpb8Jvd + LPczcu4QePsjwRCOHANu0nVHJp2I + + 72sa3 PUZZ9x8nmZRdNASA09TDjdeg + Vo6a / ao6uckcVaz5NEjV9Kub1lSVPfJWE28sslAZCQvSQC3r4Quq + WPQQmKaKmr6lkxFj2hPJM05N / eoAQtBDcJro980vx5KoYq2lSfWwfNtz // YmPDHUw8X7AWx5GghBD8FpxfVgcI9sO2kViq31BHqAzaCH4LQSv28O // bLn29RbgcUebHO8t3MT / vqictkfo79U3TY7k2gBT0Ep1Ut9tUWl0v nPRmUczdt1Ia0pCpGst / zYN3mYjXTQAh6CE6LLDZjCOdDsHM3bdT + tMGNT ++ RRDe5dh37ALY8DYSgh + A0r2JJPey7mLH6VNXij / vebT2nfTe7rkts // QV7KgHsOVpIAQ9BKcZFhsfUPb9WSebjLTV3fJe6f7t1lm + m93kZQ5PPW3zhOfLBDk19DC / 3kP / 9fTMGughMC0rqpAeNndbk29 + nqpO2jZPOL9MEFJeD0tzLvXqQA92aZqopB52s3cmkqS3FNi + mzlpQ1XMeWL1qUJFMYiiuB4WZ2x93O + / 04m + H5 + / f3Bw3N7NzcOa5djRcXNnSWHatqheFSNDXD5vk91TbEjpoxBso4Yevq33MLsOBKOHwDTbYqq08S / Cuy + KCMciwrQvUVkvretm9LCnWA96sCV29ND / E / Rgl2ZbLCZtrR60svGIeiagh3aIvvbQdehBFaVNsy3mmXZgPax8mR9DLgXowZaQO5dGE3qjBxktFPNM0x43C0V5HtDRgy0hzz2w3kORKG2abTHnNNti2jTbYqCFx + KC0yh2pjTbYto022KgBT0Ep1HsTGm2xbRptsVAC3oITqPYmdJsi2nTbIuBFvQQnEaxM6XZFtOm2RYDLeghOI1iZ0qzLaZNsy0GWtBDcBrFzpRmW0ybZlsMtKCH4DSKnSnNtpg2zbYYaEEPwWkUO1OabTFtmm0x0FJDDwvrPSwvBYEeAtNsizmn2RbTptkWAy3l9bAw59K36ZjQQ2CabTHnNNti2jTbYqCluB4WZmyd + 9IFAFqi9FEItlFDD3PrPXxdCkL4udF + BClGWuko5zTbYqDFcfTwLtfAB5piZ0qzLaZNsy0GWlq59mD7gabYmdJsi2nTbIuBlpA7l94Tei / fuQRwOObWRAQ4HCHezl3vQfKjRhfBtu66 / V7 / uF / 3JT153K + X269GkH0lhWqfha73u6DY723vZhqlSd8C2SudfMj2dtO9ocqPGTTHuYd1g6sb / V9s3G // jk2 دا + h7JPcqNhxHbU3rv / PvP2YX31tR7HG / Xj5TN1a73G4yRRR5CzSvdDBk2D960L2hyo9ZAQuCO + fWw3RX3byr / UUNdq89h + HpkW5vsed / 7vbDK + 39OjVpiiNJkbdA9Eo / XuvuQY3qDRV + zCbdoAHOrQft6OFyuf12vzfFr679N7 / iJk2zeX / n9HfFTWmjDbR39PA7 / H + 7LKF9C7Sv9FXwer / vPYIq31Ddx2xSDhrg3HoYn8Xd + yvs + 7fgmXuttjfb0atPep0s2fUaPwJ2vswCv2wK3wLlKx1m7n7NyjdU9zGD9ji7HgAAYBPoYTN / v5eJfh8TptkWayftpMUG1 / ElwyQw59x64F4LABWT6w6iE3Jgy7n10HGvBYCI6RXynfdBgTun14PuXovXRT7NPYKy5 / W0D7KpH6RSpmkfsuuUT5 + 93oLfv8R9G02YJv3QjkYLg1NNcE7OrwcRb8u8xiN79jThHbfaB9m0D1LJH8sSPmSnffps9MjDzo2mStN + aP9yOE3bDughk4 + TVL + 36 / 2heCbrze7H4qQPsokepCqSpn3I7vmfkqfP5M8S7k7TfmihOdBDJqPf9x / 36 / XqMnpQPt6lfZBKmqZ9yE749NkBRg / 9 / 93xoYXmQA / ZjE61ah9X2vPbsPjxLu2DVMI09V0GwqfPrK896D60iXBkc2bQAwCs40 + sXJc + O + غازات الدفيئة + VNIOq5qWVoixnfa6TF9AYt / cfsb2BzuzH1Ugugh0y0N4EI56bWPvqnnTTb9l6jTrrdbG / Qkr + br1LMzNcG6CGTIncuieemFlBq0myze40mgYpifjdoad / N7l3qjh6aAD1kor0JRDw9uO6XOW0x23uNJon7cL1BS / wxG5fCEGcHPWQjvwlEOT24FFkx43uNxBjfoFXuY2b1DkAB0AN84nwFXjuviexCt / H1fO27iQsaAz0cHe2ladsr8PJuwgvdttfz1ZNqvD9rToNdKAZ6OAH6S9Ov / + N7BV45r4loUg2 / 6 / ن lJtVwuyEbioAezoDu0rTzFfhS85rsvtBtez2fSTVgF + gBPnG + Al9oXhPJhW7P6 / n6STX + Il4Tf3CO6cygBwBf7Fazehb6G5bYtQMt6AFaRXhXj3pSDdm9Btqloro / PQxeLno4M + gBjoLtPVraSTVGV813nj4TLhXVZ / 5pxuxpHdCDHuBAeN6jpZ1U46PdvhesXacImgM9wJHwvEdLu4ZSH / o8KbTz4vvnt2sm1YBGQA / QKsq7erRrKH2k7soSLxUFbYEeAM6L / NI0tAR6ALBCvxCF9NI0NAR6AHBDvBAFl6ZhG + gBwA7RFXguTcMu0APAeeHSNOwAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADGLB / UWUAUIMeYDO / t8v1 / vtaUWC69swCn / 945epoqXULHvdrv / LmdFGDVd0AoOs69AA7 + DxMVzsE / 95ut89Fz35vw7HHYGnl / qubl2sGaBf0AGv5O9xebrfE6GEoifd / v77lMljzePylwXdd7 / FX3 / Y819kcLoo5XXlzlD4oCQDZoAdYxfvI + 7hfL1l6GPxVP954 / d17APLxpclfDn / + 9f4Yno / KGbVwcglgPegB1jBdu / irHpKH5r + / HF50eKkgPf54f9 / bHL2mvq6gjB4A1oMeYA0fx + LH / Zqnh7lrxR9H7de / W9LD8AL068wToweAMqAHWEPs6OHTNK9vnv6A1KADPQCsBD3AKga3Bf3eEtceBpcLXg8zDI7Nj9E / nrv2kNbD4379OMb3cnk2ebz / OnHFAj0ArAQ9wFoW71wanAC63u / D4 / eKO5fSehjb4ePKdR / Dcw8AItADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACdADAAAkQA8AAJAAPQAAQAL0AAAACf4 DElSXvkQP4FMAAAAASUVORK5CYII =

عفوًا & # 33 اعتقدت أنه يمكنني لصق الصور. آسف & # 33 أتمنى أن يكون توضيحي واضحًا بدرجة كافية.


ELISA استكشاف الأخطاء وإصلاحها

يوفر دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها مصادر وحلول محتملة للمشكلات الشائعة التي تمت ملاحظتها مع مجموعات ELISA الجاهزة للاستخدام أو عند تطوير ELISA جديد.

الكواشف المضافة بترتيب غير صحيح ، أو أعدت بشكل غير صحيح

  • كرر التجربة ، باتباع بروتوكول إعداد الحل وترتيب الإضافة عن كثب.

تركيز الجسم المضاد منخفض جدًا

  • زيادة تركيز الجسم المضاد الأولي أو الثانوي (قد تكون المعايرة مفيدة). يمكن استخدام مجموعات تركيز الأجسام المضادة Novus لزيادة تركيز الجسم المضاد الأولي.
  • زيادة وقت الحضانة إلى 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

الأجسام المضادة الأولية والثانوية غير متوافقة

  • تأكد من أن الجسم المضاد الثانوي قد تم رفعه ضد الأنواع التي تم رفع الأولي فيها (على سبيل المثال ، إذا تم رفع الأساسي في الماوس ، فاستخدم جسمًا مضادًا ثانويًا مضادًا للفأر).

لم يلتصق الجسم المضاد الذي تم التقاطه (لساندويتش ELISA) أو المستضد (من أجل ELISA غير المباشر) باللوحة

  • استخدم لوحة تم التحقق من صحتها لـ ELISAs ، وليس لوحة زراعة الأنسجة. تحقق من أن سعة الربط للوحة مناسبة لربط مولد الضد أو الجسم المضاد.
  • زيادة مدة خطوة الطلاء إلى 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

تتعرف أجسام الالتقاط والكشف على نفس الحاتمة (لساندويتش ELISA)

  • تحقق من أن كلا الأجسام المضادة تتعرف على حواتم مميزة. استخدم زوجًا مختلفًا من أجسام الالتقاط والكشف وجرب زوجًا متطابقًا تم التحقق من صحته ، إذا كان متاحًا.
  • إذا كان هناك & rsquos توفر محدود من الأجسام المضادة الأولية التي تتعرف على المستضد محل الاهتمام ، فجرّب نوعًا مختلفًا من ELISA. يتطلب ELISA غير المباشر أو التنافسي جسمًا مضادًا أوليًا واحدًا فقط.

أصبح المعيار سيئًا (إذا كانت هناك إشارة في آبار العينة)

  • تحقق من أن هذا المعيار قد تم إعداده وفقًا للتعليمات. إذا تم استخدام المعيار المجفف بالتجميد ، أجهزة الطرد المركزي قبل إعادة التشكيل.
  • استخدم قنينة جديدة. قد يكون المعيار قد تدهور إذا تم استخدامه بعد تاريخ انتهاء صلاحيته أو إذا ترك في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة من الزمن.

العينة البيولوجية ليست في النطاق القابل للكشف

  • قم بإجراء تخفيف متسلسل للعينة وابدأ بعينة أكثر تركيزًا للاختبار.
  • ارفع العينة بتركيز معروف للمستضد للتحقق من التداخل المحتمل.

تحتوي المخزن المؤقت على أزيد

  • أزيد الصوديوم (غالبًا ما يستخدم لتخزين الأجسام المضادة الأولية) يثبط نشاط HRP. تأكد من الغسيل الكافي لإزالة وجود أزيد الصوديوم أو استخدام محاليل خالية من أزيد الصوديوم

الغسل أو المنع غير الكافي

  • زيادة عدد و / أو مدة الغسيل.
  • زيادة وقت الحجب و / أو تركيز المانع ، (مثل BSA ، الكازين أو الجيلاتين). ترتبط حاصرات البروتين بالمواقع غير المأهولة على لوحة ELISA وتمنع الارتباط غير المحدد.
  • أضف المنظفات لغسل المخازن المؤقتة لتقليل الارتباط غير المحدد. يستخدم Tween-20 ، وهو منظف غير أيوني ، عادةً بتركيز يتراوح بين 0.01-0.1٪.

تركيز الجسم المضاد مرتفع للغاية

تم تحضير محلول الركيزة مبكرًا جدًا وتحول إلى اللون الأزرق (للكشف اللوني باستخدام ركيزة معينة مثل TMB)

التأخير في لوحة القراءة (للكشف اللوني)

كاشف HRP شديد التركيز

الخزانات أو السدادات اللوحية أو رؤوس الماصة أو المخزن (المخازن) الملوثة بـ HRP

  • قد تبقى كميات ضئيلة من HRP في البلاستيك المعاد استخدامه وتحول محاليل الركيزة ، مثل تلك التي تحتوي على TMB ، باللون الأزرق. استخدم البلاستيك الطازج لكل خطوة.
  • تحضير مخازن جديدة.

تقلبات عالية بين النسخ المتماثلة

ضمن نفس التجربة

الخلط غير الكافي للحلول أو طلاء الألواح غير المستوي

  • كرر التجربة وتأكد من خلط كل حل تمامًا قبل إضافته إلى لوحة ELISA.
  • تحقق من أن هذا ليس خطأ ماصة. أضف كمية متساوية من محلول الطلاء لكل بئر.
  • استخدم صفيحة مانعة للتسرب لتجنب التبخر أثناء خطوة الطلاء.
  • في حالة استخدام جسم مضاد للالتقاط بتركيز أقل بكثير من الكمية المطلوبة لتشبع جميع مواقع الربط في البئر ، فقد يكون من الضروري زيادة مدة خطوة الطلاء لتحقيق توازن الارتباط.

عدم كفاية غسل الآبار

  • تأكد من عدم وجود محلول متبقي في الآبار بين خطوات الغسيل.
  • زيادة عدد و / أو مدة الغسيل.

عازلة ملوثة أو أطراف ماصة

  • تحضير مخازن جديدة.
  • استخدم نصائح جديدة عند توزيع المحاليل أو تجنب التلوث المرحل.

تحتوي اللوحة على فقاعات تؤثر على القراءة البصرية

بين تجارب متعددة

قد تكون الحلول قديمة

  • تحضير حلول جديدة لكل تجربة. قد تكون الرواسب موجودة في المخزن المؤقت أو قد تكون سعة التخزين المؤقت للمحلول غير كافية.

لا يتم تحضير العينات البيولوجية بنفس الطريقة

  • استخدم نفس المعالجة التجريبية ومخازن ELISA المعيارية للعينات.
  • الحد من تجميد الذوبان.
  • أضف نفس الكمية من العينة وبنفس التخفيف.

الاختلافات في درجة حرارة الحضانة و / أو الوقت

  • استخدم درجة حرارة وفترات الحضانة الموصى بها.
  • تجنب استخدام أطباق التفريخ في المناطق التي تختلف فيها الظروف البيئية.

نطاق ديناميكي ضعيف بين الإشارة والخلفية

تركيز HRP منخفض جدًا

لوحة القراءة تستخدم الطول الموجي غير الصحيح

  • تحقق من المرشحات / القارئ. استخدم الأطوال الموجية المنصوص عليها في البروتوكول للركيزة الكروموجين أو الفلوروكروم.

أوقات التطوير غير كافية (للكشف اللوني)

التخفيف غير المناسب للمنحنى القياسي

الكشف عن الأجسام المضادة مخفف للغاية

تحقق من أداتك

  • تحقق من أن اللوحة مسطحة في قارئ اللوحة واقرأها مرة أخرى.
  • اقلب اللوحة 180 درجة واقرأها مرة أخرى. إذا استمر ملاحظة تأثير الحافة / الانجراف في نفس الموضع ، على الرغم من قلب اللوحة ، فقد تحتاج الأداة إلى الإصلاح. إذا استمر ملاحظة تأثير الحافة / الانجراف ولكن الآن في الموضع الذي يتوافق مع اللوحة المقلوبة ، فقد تكون إحدى المشكلات أدناه هي السبب.

درجة حرارة المختبر غير المتكافئة

  • تجنب استخدام أطباق التفريخ في المناطق التي تختلف فيها الظروف البيئية.
  • استخدم صفيحة مانعة للتسرب لتجنب التبخر.

المحاليل ليست في درجة حرارة الغرفة

  • تأكد من أن جميع الحلول في درجة حرارة الغرفة قبل سحبها إلى الآبار ، ما لم تشير ورقة بيانات الجسم المضاد إلى خلاف ذلك.

انقضت فترة زمنية كبيرة أثناء إضافة الحل


دليل تطوير ELISA

عند تطوير ELISA جديد لمستضد معين ، فإن الخطوة الأولى هي تحديد استراتيجية تجميد وتحسين ظروف طلاء اللوحة لمولد الضد أو التقاط الجسم المضاد. على الرغم من أننا نستخدم عمومًا لوح البولي فينيل / البوليسترين 96/384 جيدًا كمرحلة صلبة من ELISA ، فهناك بالفعل مجموعة متنوعة من مواد الطور الصلب التي يمكن استخدامها (انظر الجدول 1).

الجدول 1. أنواع الأطوار الصلبة المناعية

المادة قدرة الربط نوع التفاعل
نيتروسليلوز عالي مسعور ، ماء
بوليفينيليدين ثنائي فلوريد (PVDF)
نايلون عالي نافرة من الماء
لوحة وأنابيب
البوليسترين قليل نافرة من الماء
بولي فينيل قليل نافرة من الماء
اللوحات المعدلة قليل تساهمي ، كاره للماء ، ماء
خرز
البوليسترين معتدل نافرة من الماء
البوليسترين المعدل عالي تساهمي ، كاره للماء ، ماء
الجسيمات الدقيقة عالي تساهمي ، كاره للماء

يمكن تعريف التثبيت على أنه ارتباط الجزيئات (مستضد وجسم مضاد) بسطح مما يؤدي إلى تقليل أو فقدان القدرة على الحركة. الطريقة التي يتم بها تجميد البروتينات ستحدد خصائص ELISA. في بعض الحالات ، قد يؤدي عدم الحركة إلى فقدان جزئي أو كامل لنشاط البروتين ، بسبب التوجيه العشوائي والتشوه الهيكلي. من أجل الاحتفاظ بالنشاط البيولوجي بشكل كامل ، يجب ربط البروتينات على الأسطح دون التأثير على التشكل والوظيفة. بشكل عام ، يتم تحديد اختيار استراتيجية التثبيت المناسبة من خلال الخصائص الفيزيائية والكيميائية لكل من السطح والبروتين. تم تطوير العديد من تقنيات التثبيت في السنوات الماضية ، والتي تعتمد بشكل أساسي على الآليات الثلاث التالية: الشلل الفيزيائي والتساهمي والحيوي (انظر الشكل 1).

الشكل 1. مقارنة بين ثلاث استراتيجيات مختلفة لشل الحركة.

2. المستضد والجسم المضاد

المستضد والجسم المضاد هما عاملان رئيسيان يحددان حساسية ونوعية المقايسة. تعد نقاء واستقرار المستضد من المعلمات الرئيسية التي تؤثر على أداء ELISA. يمكن أن يعزز نقاء المستضد العالي القدرة على التقاط الجسم المضاد بحيث يزيد من حساسية المقايسة.

تصفح جميع المنتجات المتعلقة Antigen

Creative Diagnostics هي شركة متطورة في مجال التكنولوجيا الحيوية توفر بروتينات عالية النقاء / مستضدات مؤتلفة في جميع أنحاء العالم. يتم اختبار مستضدات البروتين / المؤتلف بدقة لتلبية متطلبات البحث والتطوير للحصول على جودة ممتازة ونشاط بيولوجي لا هوادة فيه وبأسعار تنافسية.

يتحكم التكوين ثلاثي الأبعاد لموقع ارتباط مولد الضد الموجود في جزء Fab من الجسم المضاد في قوة وخصوصية التفاعل مع المستضد. كلما كان التفاعل أقوى ، يمكن اكتشاف انخفاض تركيز المستضد. العامل المنافس هو خصوصية الارتباط أو التفاعل التبادلي للجسم المضاد لبروتينات المصل غير المستضد المستهدف. اعتمادًا على ما إذا كانت الأجسام المضادة المستخدمة متعددة النسيلة أو أحادية النسيلة ، فإن التفاعل التبادلي سيكون ناتجًا عن قوى مختلفة. في كلتا الحالتين ، قد يؤدي إجراء الفحص إلى حد الحساسية إلى تفاعل متقاطع ، ويواجه المرء الاحتياجات المتضاربة للحساسية مقابل الخصوصية.

يمكن استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة كأجسام مضادة لالتقاط وكشف الأجسام المضادة في أنظمة ELISA الشطيرة. تمتلك الأجسام المضادة وحيدة النسيلة خصوصية أحادية متأصلة تجاه حاتمة مفردة تسمح بالكشف الدقيق وتقدير الاختلافات الصغيرة في المستضد. غالبًا ما يتم استخدام polyclonal كجسم مضاد لالتقاط أكبر قدر ممكن من المستضد. ثم يتم استخدام أحادي النسيلة كجسم مضاد للكشف في مقايسة الشطيرة لتوفير خصوصية محسنة.

من الاعتبارات المهمة في تصميم ELISA شطيرة هو أن الأجسام المضادة للالتقاط والكشف يجب أن تتعرف على حلقتين مختلفتين غير متداخلين. عندما يرتبط مولد الضد بالجسم المضاد الملتقط ، يجب عدم حجب أو تغيير الحاتمة التي يتعرف عليها الجسم المضاد للكشف. يُطلق على الأجسام المضادة التي لا تتداخل مع بعضها البعض والتي يمكن أن ترتبط ببعضها البعض والكشف عنها "أزواج الأجسام المضادة المتطابقة" وهي مناسبة لتطوير شطيرة ELISA.

تصفح جميع المنتجات المتعلقة بالأجسام المضادة

يمكن أن تقوم Creative Diagnostics بتطوير أنسب الأزواج المتطابقة لمقايسة ELISA الخاصة بك. يمكن بدء المشاريع جنبًا إلى جنب مع خدمات تطوير الورم الهجين المخصص أو يمكن توفير الأجسام المضادة من قبل العملاء للتقييم. نحن نستخدم خبرة فريق تطوير ELISA الداخلي الخاص بنا والذي يدعم مجموعة متنوعة من منتجات ELISA.

3. استراتيجية مقترنة

الجسم المضاد المسمى بالإنزيم هو مفتاح إخراج إشارة ELISA. يتضمن اقتران الإنزيمات بالأجسام المضادة تكوين ارتباط ثابت وتساهمي بين إنزيم وجسم مضاد أحادي النسيلة أو متعدد النواقل خاص بمولد الضد حيث لا يتم تغيير موقع اتحاد المستضد في الجسم المضاد أو الموقع النشط للإنزيم وظيفيًا.

يمكن ربط العديد من إنزيمات المراسل ، مثل بيروكسيداز الفجل (HRP) ، والفوسفاتاز القلوي (AP) والعديد من الإنزيمات الأخرى ، بالأجسام المضادة والبروتينات من خلال استخدام كيميائيات اقتران مختلفة لضمان أقصى قدر من الاحتفاظ بنشاط كل من الإنزيم والبروتين.

بيروكسيداز فجل الحصان (HRP) - يمكن تصويره من خلال تفاعلات كروموجينية مثل ديامينوبنزيدين (DAB) أو التلألؤ الكيميائي. HRP عبارة عن ملصق إنزيم بروتين سكري 44 كيلو دالتون وهو أكثر استقرارًا من الفوسفاتيز القلوي.

الفوسفاتاز القلوي (AP) - هو إنزيم هيدرولاز وغالبًا ما يتم قياس إشارته من خلال الركيزة اللونية pNNP.

يرى تفاصيل كيمياء الاقتران Winston، S.E، Fuller، S. A.، Evelegh، M.J and Hurrell، J.G. 2001. Conjugation of Enzymes to Antibodies. البروتوكولات الحالية في علم الأحياء الجزيئي. 50: 1: 11.1: 11.1.1-11.1.7.

تصفح جميع المنتجات المتعلقة بالأجسام المضادة الثانوية

توفر Creative Diagnostics خدمات اقتران وسم الأجسام المضادة للإنزيمات لجزيئات توليد الإشارات باستخدام إستراتيجيتنا الخاصة بوضع العلامات على الإنزيمات.

4. إنزيم وكروموجين

المرحلة الأخيرة من ELISA هي الإملاء. سوف تتناسب شدة الإشارة الناتجة عند إضافة الركيزة بشكل مباشر مع كمية المستضد الملتقطة في اللوحة والمرتبطة بكواشف الكشف. يتم تنفيذ نظام الركيزة الإنزيمي الأكثر استخدامًا أدناه:

الجدول 2. الإنزيمات الأكثر استخدامًا وأنظمة الركيزة / الكروموفور المستخدمة في ELISA ويتغير اللون مع عوامل التوقف ذات الصلة.

تسمية الانزيم المادة المتفاعلة صبغ متعادل حل التوقف تغيير اللون قراءة الطول الموجي
غير متوقف توقفت غير متوقف توقفت
الفجل بيروكسيداز H2O2 (0.004٪) العيادات الخارجية الفوسفات / سترات درجة الحموضة 5.0 1.25 م H2SO4 برتقالي فاتح البرتقالي 450 نانومتر 492 نانومتر
H2O2 (0.004٪) TMB عازلة خلات (0.1 م) درجة الحموضة 5.6 1٪ SDS أزرق أصفر 650 نانومتر 450 نانومتر
H2O2 (0.002٪) ABTS الفوسفات / سترات ، الرقم الهيدروجيني 4.2 لا توقف لون أخضر لون أخضر 414 نانومتر 414 نانومتر
H2O2 (0.006٪) 5AS فوسفات (0.2 م) ، ودرجة الحموضة 6.8 لا توقف أسود / بني أسود / بني 450 نانومتر 450 نانومتر
H2O2 (0.02٪) ربت تريس أو PBS ، درجة الحموضة 7.4 لا توقف بنى بنى غير متاح غير متاح
الفوسفاتيز القلوية pnpp pnpp ديثانولامين (10 ملم) بالإضافة إلى MgCl2 (0.5 ملم) ، ودرجة الحموضة 9.5. 2 م كربونات الصوديوم الأخضر الأصفر الأخضر الأصفر 405 نانومتر 405 نانومتر

إطلاق النار إليسا المتاعب

قم بحل مشكلات ELISA الخاصة بك من خلال نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها هذه ، والتي تغطي الأسباب الشائعة لانحناء المعيار السيئ ، وعدم وجود إشارة أو إشارة ضعيفة ، وخلفية عالية ، ومعامل تباين كبير والمزيد. يرى التفاصيل CD ELISA استكشاف الأخطاء وإصلاحها

توفر Creative Diagnostics خدمات مجموعة أدوات تطوير ELISA التعاقدية لمجتمع R & ampD و IVD. نجري خدمات تطوير أدوات ELISA لدعم تقديم الموافقة التنظيمية. ستقوم شركة Creative Diagnostics بتنفيذ اقتراح الموافقة وتقديم النتائج والوثائق المتوقعة في الوقت المناسب وبطريقة فعالة من حيث التكلفة.

طرق الكشف:
1) امتصاص الضوء
2) كثافة الإسفار أو الاستقطاب
3) نقل طاقة الرنين الإسفار
4) التلألؤ

معالم الفحص:
1) تقييم الجدوى وتصميم المقايسة
2) الفحص الأمثل
3) التحقق من صحة الفحص
4) التصنيع


نتائج ومناقشة

إعداد الراتنج وتنقية mAb

نمت خلايا Raji B لتصل إلى تركيز 10 7 خلايا / طبق. تم جمع الخلايا وهضمها كما هو موصوف وجمع المستخلص. على الرغم من أن هذا أسفر عن مستضد MHCII ectodomain يمكن اكتشافه بسهولة من سطح الخلية (الشكل 1) ، يمكن تعديل هذه الخطوة التحضيرية من خلال استخدام أي عدد من المستضدات القابلة للذوبان المتاحة تجاريًا (على سبيل المثال ، الجلوتاثيون S-ترانسفيراز GST Cat. # G6511 Sigma-Aldrich ).

منحنى الكشف القياسي لمختبر الأبحاث. تم فحص راتنج التحكم السلبي و MHCII-Resin باستخدام بروتوكول ELISA الكلي الموضح بخمس تركيزات mAb. تم تخفيف المواد الطافية النهائية بنسبة 1: 5 واكتشافها باستخدام مقياس الطيف الضوئي لأنبوب الاختبار. تم رسم البيانات الأولية لكل مادة صمغية وملائمة من خلال تحليل الانحدار الخطي. بالإضافة إلى ذلك ، تم قياس بيانات راتينج MHCII بمعامل 5 لتعكس قيم الامتصاص الفعلية قبل التخفيف. توضح هذه البيانات جدوى التجربة لإعداد الفصل الدراسي.

بعد ذلك ، تم اقتران المستضد براتنج تقارب منشط بواسطة NHS لإنشاء روابط تساهمية بين الجزيئات المحررة والراتنج (المخطط 1). تم إنشاء راتنج التحكم السلبي عن طريق اقتران الراتينج بالإيثانولامين لمنع جميع مجموعات NHS التفاعلية. تم غسل الراتينتين باستخدام PBS وتخزينها عند 4 درجات مئوية (لا تجمد) حتى الاستخدام.

تم إنتاج MHCII mAb في ثقافة خلايا الورم الهجين خلال فترة أسبوع واحد. تمت تنقية جزيئات mAb باستخدام راتنج البروتين المؤتلف A كما هو موصوف. حصلنا على ∼3 ملغ من mAb المنقى باستخدام هذه الطريقة (البيانات غير معروضة). لقد اخترنا MHCII نظرًا لتوفر مضادات MHCII mAbs في مختبر Cobb في جامعة Case Western Reserve ، ومع ذلك ، إذا تم استخدام GST بدلاً من MHCII كمستضد مستهدف ، فإن mAbs المضادة لـ GST متاحة بسهولة (Cat. # G7781 Sigma -الدريش).

الاختبارات المعملية للبروتوكول

تم اختبار ELISA على نطاق واسع لأول مرة داخل بيئة معملية بحثية لتقييم موثوقية وجدوى البروتوكول لطلاب المدارس الثانوية عديمي الخبرة. باستخدام المعدات المدرجة في قسم الإجراءات التجريبية فقط ، أجرينا الفحص باستخدام خمسة كميات معروفة من مضادات MHCII mAb تتراوح من 100 نانوغرام إلى 1 بيكوغرام. تم تخفيف المواد الطافية النهائية بعد إضافة حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1: 5 ثم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي لأنبوب اختبار الفصل الدراسي. لقد وجدنا درجة عالية من الخطية في نتائجنا (الشكل 1) ، مما أدى إلى منحنى معياري عالي التكاثر يمكننا من خلاله بسهولة حساب تركيزات عينة mAb غير المعروفة.

تنفيذ الفصل الدراسي

لاختبار هذا التمرين المختبري في ظل الظروف المقصودة ، تم إجراء التجربة من قبل ما مجموعه 64 طالبًا في المدرسة الثانوية في سياق ثلاثة أقسام منفصلة من AP Biology في مدرسة Rocky River High School (Rocky River ، OH). داخل كل فصل ، تم تقسيم الطلاب إلى 12 مجموعة مع طالبين في كل مجموعة. كما هو موصوف في قسم الإجراءات التجريبية ، تم إعطاء كل مجموعة طلابية أربعة أنابيب ميكروفوج سعة 1.5 مل تحتوي على راتنج MHCII أو راتينج تحكم سلبي ، وتخفيف mAb قياسي وتخفيف mAb غير معروف (انظر المخطط 3). تم تعيين التخفيفات المعيارية على شكل حرف (SA عبر SF) وتم تقسيمها بين المجموعات بحيث يتم تمثيل كل تخفيف مرتين على الأقل ، على الرغم من أنه تم التأكيد للطلاب على أنه في إعداد بحث "حقيقي" ، سيتم تنفيذ جميع التخفيفات القياسية من قبل المحقق الفردي بدلاً من تجميع البيانات من الآخرين. وبالمثل ، تم تعيين التخفيفات غير المعروفة تعيين حرف (UA من خلال UD) وتم تقسيمها بحيث تم تمثيل كل تخفيف ثلاث مرات على الأقل. لاحظ المدرب التخفيفات والتركيزات الفعلية للرجوع إليها لاحقًا.

مرت كل مجموعة من الطلاب بالبروتوكول ، مما أدى في النهاية إلى توليد أربع قيم امتصاص لكل مجموعة (اثنان من عناصر التحكم السلبية ، وواحد قياسي ، وواحد غير معروف). قام الطلاب بطرح قيم التحكم السلبية من القيم التجريبية ثم قاموا بتجميع نقطتي بياناتهم ، أحدهما معيار مصحح في الخلفية والآخر مصحح في الخلفية غير معروف ، مع مجموعات الطلاب الأخرى. تم رسم البيانات التي تم الحصول عليها من المعايير الستة بتركيز mAb وتناسبها مع خوارزمية الانحدار الخطي (الشكل 2).أ). تم حساب معادلة الخط من الملاءمة ويتم عرض فاصل ثقة 95٪. باستخدام هذه المعادلة ، قام الطلاب بحساب تركيز mAb لعيناتهم غير المعروفة باستخدام بيانات الامتصاص التجريبية الخاصة بهم. تم تجميع هذه القيم ومقارنتها مع التركيز الفعلي لـ mAb (الشكل 2ب). وتجدر الإشارة إلى أنه تم حذف بعض نقاط البيانات لأن الراتينج تم التخلص منه عن طريق الخطأ بدلاً من المادة الطافية أثناء إحدى خطوات الغسيل. ومع ذلك ، حقق الطلاب ككل نتائج دقيقة للغاية تتطابق بشكل وثيق مع تركيزات mAb الفعلية.

بيانات الطالب من تنفيذ الفصل الدراسي. (أ) تناسب بيانات المنحنى القياسية والانحدار الخطي باستخدام بيانات الطالب مع الخطوط المنقطة التي تمثل فاصل الثقة 95٪. (ب) قيم تركيز الطالب mAb للعينات غير المعروفة مقارنة بالقيم المحسوبة بناءً على التركيز الفعلي المعروف لكل عينة غير معروفة. لا تُظهر هذه البيانات جدوى هذه التجربة فحسب ، بل تُظهر أيضًا أن الإجراء قوي بشكل كافٍ لضمان نتائج دقيقة بشكل معقول ضمن إعداد الفصل الدراسي بالمدرسة الثانوية.

الوصول إلى أهداف التعلم

كجزء من هذا التمرين المخبري ، كان من المتوقع أن يفهم الطلاب مفهوم وإجراءات اختبار ELISA ، وكيفية تطوير منحنى قياسي باستخدام Microsoft Excel ، وكيفية تحديد المجهول من منحنى قياسي ، وتطوير مهارات معملية جديدة (على سبيل المثال ، باستخدام micropipette) ، ولتطوير تقدير الاستخدامات العملية لـ ELISA في مجتمع اليوم. كان مطلوبًا من كل طالب إكمال ورقة عمل حول التجربة (الجدول 1) جنبًا إلى جنب مع تقرير معمل يتضمن بياناتهم الأولية والقيم المحسوبة لعيناتهم غير المعروفة والرسم البياني القياسي للمنحنى باستخدام بيانات الفصل المجمعة. وجدنا أن معظم الطلاب فهموا المفاهيم الجزيئية الأساسية التي تتمحور حول ارتباط الجسم المضاد بمستضده واستخدام تفاعل إنزيمي متغير اللون كطريقة للكشف. ومع ذلك ، على الرغم من أن هذه المفاهيم كانت مفهومة بشكل عام ، إلا أن بعض الطلاب واجهوا صعوبة في الكيمياء الأساسية ، وخاصة دور حمض الهيدروكلوريك ، وتعتمد هذه الصعوبة على تعرضهم للكيمياء في المدرسة الثانوية. ومع ذلك ، كان العديد من الطلاب قادرين على الربط بين التمرين المخبري واستخدام هذه التكنولوجيا في العيادة ، وخاصة في مثال فيروس نقص المناعة البشرية. في البداية ، بدا أن الطلاب لا يقدرون تمامًا أهمية أدوات التحكم والغسيل الدقيق أثناء الإجراء ، ولكن بحلول نهاية التجربة ، يمكنهم أن يروا بشكل مباشر الحاجة إلى راتنج التحكم كخلفية وإمكانية حدوث إيجابية كاذبة وكاذبة -نتائج سلبية. بشكل عام ، يبدو أن الطلاب اكتسبوا تقديراً قوياً للمفاهيم وتطبيقها على أبحاث "العالم الحقيقي" والاختبارات السريرية ، مع اكتساب فهم أكبر لعناصر التحكم وقضايا التصميم التجريبية الأساسية الأخرى.

1. لماذا راتنج التحكم ضروري؟
2. حدد الكاشف التالي بالاسم:
(أ) الجسم المضاد الأولي ، (ب) الجسم المضاد الثانوي ، (ج) الإنزيم ، (د) الركيزة
3. لماذا يتم اختبار كل معيار وكل مجهول عدة مرات في جميع الفئات؟
4. ما هو الغرض من غسل الراتنج قبل إضافة كل كاشف؟
5. ما هو الغرض من إضافة 1 M HCl في نهاية اليوم 3؟ يشرح.
6. اشرح المقصود بالنتيجة الإيجابية الكاذبة. قم بتسمية خطأ واحد من شأنه أن يؤدي إلى إيجابية كاذبة.
7. اشرح المقصود بنتيجة سلبية خاطئة. اسم خطأ واحد من شأنه أن يؤدي إلى خطأ سلبي.
8.باستخدام معلومات ELISA الخاصة بك ، والكتاب المدرسي ، والإنترنت إذا لزم الأمر ، اشرح كيف يتم استخدام هذا النوع المعين من المقايسة لتشخيص فيروس نقص المناعة البشرية ، الفيروس المرتبط بالإيدز.

مزالق الطلاب المشتركة

الخطأ الأساسي الذي يجب الانتباه إليه هو التخلص العرضي من حبيبات الراتنج أثناء خطوات الغسيل المتعددة. تعتمد دقة هذا الاختبار أيضًا على قيام الطلاب بصب المادة الطافية بعناية ، حتى لا يتم إزالة الراتنج في كل مرة يتم فيها غسل الراتنج أو احتضانه. أخيرًا ، من المهم التأكد من أن الطلاب على دراية بالفرق بين أحجام الميكرولتر والميلليتر ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى نتائج غير دقيقة للغاية وإهدار الكواشف.


فحوصات ELISA: غير مباشرة ، ساندويتش ، وتنافسية

المصدر: ويتني سوانسون 1،2 ، فرانسيس ف. سجاستاد 2،3 ، وتوماس س.جريفث 1،2،3،4
1 قسم جراحة المسالك البولية ، جامعة مينيسوتا ، مينيابوليس ، مينيسوتا 55455
2 مركز علم المناعة ، جامعة مينيسوتا ، مينيابوليس ، مينيسوتا 55455
3 برنامج الدراسات العليا في علم الأحياء الدقيقة والمناعة وبيولوجيا السرطان ، جامعة مينيسوتا ، مينيابوليس ، مينيسوتا 55455
4 مركز السرطان الماسوني ، جامعة مينيسوتا ، مينيابوليس ، مينيسوتا 55455

كثيرًا ما يتم استخدام مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لقياس وجود و / أو تركيز مستضد أو جسم مضاد أو ببتيد أو بروتين أو هرمون أو جزيء حيوي آخر في عينة بيولوجية. إنه حساس للغاية ، وقادر على اكتشاف تركيزات منخفضة من المستضد. تُعزى حساسية ELISA إلى قدرتها على اكتشاف التفاعلات بين معقد واحد لجسم مضاد للمستضد (1). علاوة على ذلك ، فإن إدراج جسم مضاد خاص بمولد مضاد مترافق بالإنزيم يسمح بتحويل ركيزة عديمة اللون إلى منتج كروموجين أو فلورسنت يمكن اكتشافه وتحديد كميته بسهولة بواسطة قارئ لوحة. عند مقارنتها بالقيم المتولدة عن كميات معايرة لمولد ضد معروف موضع اهتمام ، يمكن تحديد تركيز نفس المستضد في العينات التجريبية. تم تكييف بروتوكولات ELISA المختلفة لقياس تركيزات المستضد في مجموعة متنوعة من العينات التجريبية ، ولكن لديهم جميعًا نفس المفهوم الأساسي (2). يعتمد اختيار نوع ELISA المطلوب إجراؤه ، غير مباشر ، أو شطيرة ، أو تنافسي ، على عدد من العوامل ، بما في ذلك مدى تعقيد العينات المراد اختبارها والأجسام المضادة الخاصة بالمستضد المتاحة للاستخدام. كثيرًا ما يتم استخدام ELISA غير المباشر لتحديد نتيجة الاستجابة المناعية ، مثل قياس تركيز الجسم المضاد في العينة. تعتبر الساندويتش ELISA هي الأنسب لتحليل العينات المعقدة ، مثل طاف زراعة الأنسجة أو محللات الأنسجة ، حيث يكون التحليلي ، أو المستضد محل الاهتمام ، جزءًا من عينة مختلطة. أخيرًا ، غالبًا ما يتم استخدام ELISA التنافسي عندما يكون هناك جسم مضاد واحد متاح للكشف عن مولد الضد محل الاهتمام. تعتبر ELISA التنافسية مفيدة أيضًا في اكتشاف مستضد صغير مع حاتمة واحدة فقط من الجسم المضاد لا يمكنها استيعاب اثنين من الأجسام المضادة المختلفة بسبب العائق الفراغي. سيصف البروتوكول الإجراءات الأساسية لمقايسات ELISA غير المباشرة والساندويتش والتنافسية.

يشيع استخدام مقايسة ELISA غير المباشرة لقياس كمية الأجسام المضادة في مصل الدم أو في المادة الطافية لثقافة الورم الهجين. الإجراء العام لفحص ELISA غير المباشر هو:

  1. تغطية الآبار بالمستضدات
  2. إضافة مصل أو مستنبت الورم الهجين يحتوي على جسم مضاد (أساسي أو جسم مضاد 1 & # 176)
  3. احتضان وغسل
  4. أضف الأجسام المضادة الثانوية (أو 2 & # 176) الإنزيم المترافق
  5. احتضان واغسل
  6. أضف الركيزة

يختلف اختبار ELISA الشطري عن مقايسة ELISA غير المباشرة في أن الطريقة لا تتضمن طلاء الألواح بمولد ضد منقى. بدلاً من ذلك ، يتم استخدام الجسم المضاد & # 34capture & # 34 لتغطية آبار اللوحة. يكون المستضد & # 34 محاطًا & # 34 بين الجسم المضاد الذي تم التقاطه وجسم مضاد ثانٍ & # 34 & # 34 الكشف عن الإنزيم - حيث يكون كلا الجسمين المضادين محددًا لنفس المستضد ، ولكن في حلقات مختلفة (3). من خلال الارتباط بمركب الجسم المضاد / المستضد الملتقط ، يظل الجسم المضاد للكشف في اللوحة. يمكن استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أو المضاد متعدد النسيلة كأجسام مضادة للالتقاط والكشف. الميزة الرئيسية لشطيرة ELISA هي أنه لا يلزم تنقية العينة قبل التحليل. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون الفحص حساسًا جدًا (4). العديد من مجموعات ELISA المتاحة تجاريًا من مجموعة متنوعة من الشطائر وتستخدم أزواجًا متطابقة تم اختبارها من الأجسام المضادة. الإجراء العام لمقايسة ELISA شطيرة هو:

  1. تغطية الآبار مع التقاط الجسم المضاد
  2. أضف عينات اختبار تحتوي على مستضد
  3. احتضان وغسل
  4. إضافة الجسم المضاد للكشف عن الإنزيم المترافق.
  5. احتضان واغسل
  6. أضف الركيزة

تأتي معظم مجموعات ELISA الشطيرة المتاحة تجارياً مع أجسام مضادة للكشف عن الإنزيم المترافق. في الحالات التي لا يتوفر فيها الجسم المضاد للكشف عن الإنزيم المترافق ، يمكن استخدام جسم مضاد ثانوي مترافق بالإنزيم خاص بالجسم المضاد للكشف. يؤدي الإنزيم الموجود على الجسم المضاد الثانوي نفس الدور ، وهو تحويل الركيزة عديمة اللون إلى منتج كروموجين أو فلورسنت. يرغب الجسم المضاد المرتبط بالإنزيم الثانوي المذكور أعلاه في استخدامه في & # 34 محليًا & # 34 شطيرة ELISA التي طورها المحقق الذي أنتج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة به ، على سبيل المثال. أحد العوائق لاستخدام الجسم المضاد الثانوي المرتبط بالإنزيم هو التأكد من أنه يرتبط فقط بالجسم المضاد للكشف ، وليس الجسم المضاد الملتصق باللوحة. سيؤدي ذلك إلى منتج قابل للقياس في جميع الآبار ، بغض النظر عن وجود أو عدم وجود مستضد أو جسم مضاد للكشف.

أخيرًا ، يتم استخدام اختبار ELISA التنافسي للكشف عن المستضدات القابلة للذوبان. إنه سهل التنفيذ ، ولكنه مناسب فقط عندما يكون المستضد المنقى متاحًا بكمية كبيرة نسبيًا. الإجراء العام لمقايسة ELISA التنافسي هو:

  1. تغطية الآبار بالمستضد
  2. احتضان وغسل
  3. احتضان عينة الاختبار مع الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بالإنزيم
  4. أضف الخليط جيدًا
  5. احتضان وغسل أي جسم مضاد أولي غير مرتبط بالإنزيم
  6. أضف الركيزة

تأتي المنافسة & # 34 & # 34 في هذا الاختبار من حقيقة أن المزيد من المستضدات في عينة الاختبار المستخدمة في الخطوة 3 ستؤدي إلى تقليل الأجسام المضادة المتاحة للارتباط بطبقة المستضد البئر. وبالتالي ، فإن شدة المنتج chromogenic / الفلوروجينيك في البئر في نهاية الفحص ترتبط عكسيًا بكمية المستضد الموجودة في عينة الاختبار.

أحد المكونات الرئيسية في أي نوع من أنواع ELISA هو المعايير المُعايرة للتركيزات المعروفة التي تسمح للمستخدم بتحديد تركيز المستضد الموجود في عينات الاختبار. عادة ، يتم تخصيص سلسلة من الآبار لإنشاء منحنى قياسي ، حيث يتم إضافة الكميات المعروفة من البروتين المؤتلف المنقى إلى الآبار بكميات متناقصة. عندما تتم معالجة هذه الآبار في نفس الوقت مع عينات الاختبار ، يمكن للمستخدم بعد ذلك الحصول على مجموعة مرجعية من قيم الامتصاص التي تم الحصول عليها من قارئ الصفيحة الدقيقة لتركيزات البروتين المعروفة لتتماشى مع قيم الامتصاص لعينات الاختبار. يمكن للمستخدم بعد ذلك حساب منحنى قياسي يمكن من خلاله مقارنة عينات الاختبار لتحديد كمية البروتين محل الاهتمام الموجود. يمكن أن يحدد المنحنى القياسي أيضًا درجة دقة عملية التخفيف التي يقوم بها المستخدم.

أخيرًا ، تستدعي الخطوة الأخيرة في كل نوع من أنواع ELISA المذكورة أعلاه إضافة ركيزة. ترتبط درجة تحويل الركيزة إلى منتج ارتباطًا مباشرًا بكمية الإنزيم الموجودة في البئر. يعتبر بيروكسيديز الفجل (HRP) والفوسفاتاز القلوي (AP) من أكثر الإنزيمات شيوعًا المرتبطة بالأجسام المضادة. كما هو متوقع ، هناك عدد من الركائز المتاحة المحددة إما للإنزيم الذي ينتج منتجًا كروموجينيًا أو فلورسنت. علاوة على ذلك ، تتوفر ركائز في مجموعة من الحساسيات التي يمكن أن تزيد من الحساسية الكلية للمقايسة. يجب على المستخدم أيضًا أن يأخذ في الاعتبار نوع الأجهزة المتاحة لقراءة اللوحة في نهاية التجربة عند اختيار نوع الركيزة المراد استخدامها ، جنبًا إلى جنب مع الجسم المضاد المرتبط بالإنزيم المقابل.

تشتمل الركائز الكروموجينية المستخدمة بشكل شائع لـ HRP على 2،2 & # 39-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid] -diammonium salt (ABTS) و 3،3 & # 39،5،5 & # 39-tetramethylbenzidine (TMB) ، بينما ص-فوسفات النيتروفينيل (PNPP) يستخدم في AP. تنتج ABTS و TMB منتجات تفاعل ذات لون أخضر وأزرق قابلة للذوبان في الماء ، على التوالي. يتميز منتج ABTS الأخضر بقممتين رئيسيتين للامتصاص ، 410 و 650 نانومتر ، بينما يتم اكتشاف منتج TMB الأزرق بشكل أفضل عند 370 و 652 نانومتر. تتغير ألوان ABTS و TMB إلى اللون الأصفر عند إضافة محلول التوقف الحمضي ، والذي يمكن قراءته بشكل أفضل عند 450 نانومتر. تطوير الألوان لـ ABTS بطيء ، في حين أنه سريع لـ TMB. TMB أكثر حساسية من ABTS ، وقد ينتج عنه إشارة خلفية أعلى إذا استمر التفاعل الأنزيمي لفترة طويلة. ينتج PNPP منتجًا أصفر قابل للذوبان في الماء بعد تحويل AP يمتص الضوء عند 405 نانومتر.

إجراء

1. ELISA غير المباشر

إن ELISA غير المباشر هو الذي يتم فيه التعرف على الجسم المضاد الأولي الخاص بالمستضد بواسطة جسم مضاد ثانوي مترافق. البروتوكول التالي هو مثال على طريقة ELISA غير المباشرة ، حيث يتم اختبار عينات مصل الفئران المصابة بفيروس الأنفلونزا A (IAV) لوجود الأجسام المضادة IgG الخاصة بـ IAV. تتمثل إحدى نقاط القوة في هذا المثال في أنه يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية المختلفة التي تتعرف على جميع الأنماط المتماثلة للأجسام المضادة أو الأنماط المتماثلة المحددة (على سبيل المثال ، IgG).

مستضد طلاء على صفيحة ميكروسكوبية

  1. قم بتغطية آبار صفيحة ELISA ذات 96 بئر مع مستضد منقى عن طريق الماصات 50 & # 181 لتر من المستضد المنقى (2 مجم / مل من فيروس الإنفلونزا A / PR / 8 المنقى في 0.05M Tris-HCl المخزن المؤقت (pH 9.5)) في كل بئر من الطبق.
  2. قم بتغطية اللوح بغطاء لاصق واحتضانه طوال الليل عند 4 & # 176 درجة مئوية للسماح للمستضد بالالتصاق باللوحة.
  3. عند اكتمال الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.
  1. قم بحظر مواقع ربط البروتين المتبقية في الآبار المطلية عن طريق إضافة 200 & # 181L منعًا مؤقتًا ، ويستخدم 5 ٪ من مصل الحمير في 1X PBS هنا ، لكل بئر. تشتمل كواشف الحجب البديلة على 5٪ حليب جاف خالي الدسم أو BSA في PBS أو مصل طبيعي من حيوان تم فيه تكوين الجسم المضاد الثانوي.
  2. احتضان لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 & # 176 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر عن طريق النقر على اللوحة ثم اغسل اللوحة باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ توين -20.

الحضانة مع الجسم المضاد الأساسي

  1. قم بإعداد تخفيف متسلسل لعينة المصل ، التي تحتوي على الجسم المضاد الأولي ، للحصول على نطاق تخفيف من 1 إلى 204،800 ، باستخدام 1X PBS. للقيام بذلك ، قم أولاً بتخفيف المصل 1: 12.5 ثم قم بإجراء تخفيف 4X (نطاق التخفيف - 1: 12.5 إلى 1: 204،800).
  2. أضف 100 & # 181 لتر من عينات المصل المخفف تسلسليًا إلى الآبار.
  3. تغطية لوحة مع غطاء لاصق ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة.
  4. بعد الحضانة ، نفض الغبار على اللوحة فوق بالوعة ويغسل لوحة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ توين -20.

الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي

  1. أضف 100 & # 181 لتر من جسم مضاد ثانوي مترافق بالإنزيم ، بيروكسيديز الفجل ، مضاد للفأر مترافق مع HRP في هذه التجربة ، إلى كل بئر.
  2. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد الحضانة ، نفض الغبار عن اللوحة فوق الحوض ثم اغسل اللوحة باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ توين -20.
  1. أضف 100 & # 181L من ركيزة المؤشر (3،3 & # 39،5،5 & # 39-tetramethylbenzidine (TMB)) بتركيز 1 مجم / مل لكل بئر.
  2. احتضان اللوحة مع الركيزة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 & # 181L 2N حامض الكبريتيك (H.2وبالتالي4).
    في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول التوقف ، اقرأ اللوحة باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية عند 405 نانومتر لتحديد امتصاص الآبار.

2. ساندويتش إليسا

في إصدار ELISA هذا ، تكون العينة التجريبية & # 34 محشوة & # 34 بين جسم مضاد للالتقاط غير المقترن وجسم مضاد للكشف المترافق ، وكلاهما خاص بنفس البروتين ولكن في حلقات مختلفة. في مثال ELISA التالي ، تم تحديد تركيز TNF البشري & # 945 في عينة غير معروفة باستخدام منحنى قياسي ناتج من التخفيف التسلسلي 2.5X لمعيار معروف ، مؤتلف بشري TNF & # 945 (ينص على تركيز 75 بيكوغرام / مل).

طلاء جسم الالتقاط على الصفيحة الدقيقة

  1. قم بتغطية آبار صفيحة ELISA ذات 96 بئرًا بجسم مضاد للالتقاط المنقى عن طريق إضافة 100 & # 181L من الأجسام المضادة الملتقطة (نطاق 1-10 & # 181g / mL) لكل بئر من اللوحة.
  2. لوحة تغطية بغطاء لوح لاصق واحتضانها طوال الليل عند 4 & # 176 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء من اللوحة عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.
  1. قم بإغلاق مواقع الارتباط المتبقية بالبروتين في الآبار المطلية بالأجسام المضادة عن طريق إضافة 200 & # 181L محلول مانع ، و 5٪ حليب جاف خالي الدسم يحتوي على PBS ، إلى الآبار.
  2. احتضان لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 & # 176 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر عن طريق النقر على اللوحة ثم اغسل اللوحة باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ توين -20.

أضف عينات اختبار تحتوي على مستضد

  1. أضف 100 & # 181L من عينة الاختبار إلى الآبار. ختم اللوح بغطاء لاصق.
  2. احتضان لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 & # 176 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة ، قم بإزالة العينات عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض ثم اغسل الآبار بـ 200 & # 181L 1X PBS التي تحتوي على 1 ٪ توين -20.

إضافة الجسم المضاد للكشف عن الإنزيم المترافق

  1. أضف 100 & # 181L من الأجسام المضادة للكشف عن الإنزيم المترافق إلى الآبار بتركيز مُحسَّن مسبقًا.
  2. ختم اللوح بغطاء لاصق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
  3. قم بإزالة الجسم المضاد للكشف غير المنضم عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض وغسل الآبار باستخدام 200 & # 181L 1X PBS التي تحتوي على 1٪ توين -20.
  1. أضف 100 & # 181L من ركيزة المؤشر بتركيز 1 مجم / مل. أي جسم مضاد للكشف عن الإنزيم المترافق سيحول الركيزة إلى إشارة يمكن اكتشافها.
  2. احتضان اللوحة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد 5-10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 & # 181L 2N H2وبالتالي4 على الآبار. في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف ، اقرأ اللوحة باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية لتحديد امتصاص الآبار.

3. اليزا التنافسية

تختلف خطوات ELISA التنافسي عن تلك المستخدمة في ELISA غير المباشر والساندويتش ، مع الاختلاف الرئيسي هو خطوة الربط التنافسي بين مستضد العينة ومستضد & # 34add-in & # 34. يتم تحضين عينة المستضد مع الجسم المضاد الأولي غير المسمى. يتم بعد ذلك إضافة معقدات الأجسام المضادة - المستضد إلى لوحة ELISA ، والتي تم تغطيتها مسبقًا بنفس المستضد. بعد فترة الحضانة ، يتم غسل أي جسم مضاد غير منضم. هناك علاقة عكسية بين كمية الجسم المضاد الحر المتاح لربط مولد الضد في البئر وكمية المستضد في العينة الأصلية. على سبيل المثال ، قد تحتوي عينة تحتوي على مستضد وفير على المزيد من معقدات الأجسام المضادة الأولية للمستضد ، مما يترك القليل من الجسم المضاد غير المرتبط بصفيحة ELISA. ثم يتم إضافة جسم مضاد ثانوي مترافق بالإنزيم خاص بالجسم المضاد الأولي إلى الآبار ، متبوعًا بالركيزة.

مستضد طلاء على صفيحة ميكروسكوبية

  1. قم بتغطية آبار صفيحة ELISA ذات 96 بئر مع 100 & # 956L من المستضد المنقى بتركيز 1-10 & # 956 جم / مل.
  2. لوحة تغطية بغطاء لوح لاصق واحتضان اللوحة طوال الليل عند 4 & # 176 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول المستضد غير المنضم من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.
  1. قم بإغلاق مواقع الارتباط بالبروتين المتبقية في الآبار المطلية عن طريق إضافة 200 & # 956L من المخزن المؤقت للحظر لكل بئر ، والذي يمكن أن يكون إما حليب جاف خالي الدسم بنسبة 5٪ أو BSA في PBS.
  2. احتضان اللوحة لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 & # 176 درجة مئوية.

عينة الحضانة (مستضد) مع الجسم المضاد الأولي

  1. أثناء سد الآبار ، قم بإعداد خليط المستضد والأجسام المضادة عن طريق خلط مستضد عينة 150 & # 956 لتر و 150 & # 956 لترًا من الجسم المضاد الأولي لكل بئر في الفحص.
  2. احتضان هذا الخليط لمدة 1 ساعة عند 37 & # 176 درجة مئوية.

أضف خليط المستضد والأجسام المضادة إلى البئر

  1. الآن ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.
  2. ثم اغسل الآبار بـ 1X PBS التي تحتوي على توين -20.
  3. أضف 100 & # 956L من خليط عينة الأجسام المضادة الأولية للمستضد.
  4. احتضان اللوحة في 37 & # 176 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. قم بإزالة خليط العينة عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.
  6. بعد ذلك ، اغسل الآبار باستخدام برنامج تلفزيوني 1X يحتوي على 1٪ توين -20 لإزالة أي جسم مضاد غير منضم.

أضف الجسم المضاد الثانوي

  1. أضف 100 & # 956L من الجسم المضاد الثانوي المترافق بالإنزيم ، والذي هو في هذه الحالة جسم مضاد مترافق مع AP ، إلى كل بئر.
  2. احتضان اللوحة لمدة 1 ساعة عند 37 & # 176 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة ، اغسل اللوحة مع 1X PBS التي تحتوي على 1٪ توين -20.
  1. أضف 100 & # 956L من محلول الركيزة إلى كل بئر.
  2. انتظر لمدة 5-10 دقائق.
  3. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 & # 956L 2N حامض الكبريتيك إلى الآبار. بعد ذلك ، قم بقياس الامتصاصية في قارئ صفيحة ميكروسكوبية في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف

الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم ، أو ELISA هو اختبار كمي شديد الحساسية يستخدم عادة لقياس تركيز مادة تحليلية مثل السيتوكينات والأجسام المضادة في عينة بيولوجية. يتضمن المبدأ العام لهذا الاختبار ثلاث خطوات: البدء بالتقاط ، أو تثبيت ، المادة التحليلية المستهدفة على لوحة ميكروية ، متبوعة باكتشاف التحليل بواسطة بروتينات الكشف الخاصة بالهدف ، وأخيرًا ، تفاعل الإنزيم ، حيث يكون الإنزيم المترافق يحول ركائزه إلى منتج ملون. استنادًا إلى طرق مختلفة للالتقاط والكشف ، يمكن أن تكون ELISA من أربعة أنواع: مباشرة ، وغير مباشرة ، وشطيرة ، وتنافسية.

بالنسبة إلى ELISA المباشر ، يتم ربط المستضد المستهدف أولاً باللوحة ، ثم يتم اكتشافه بواسطة جسم مضاد محدد للكشف. تستخدم هذه الطريقة بشكل شائع لفحص الأجسام المضادة لمستضد معين. يتم استخدام ELISA غير المباشر للكشف عن الأجسام المضادة في عينة من أجل تحديد الاستجابات المناعية. يتم طلاء اللوحة أولاً بمولد ضد التقاط محدد ، والذي يعمل على شل حركة الجسم المضاد المستهدف ، ثم يتم اكتشاف مركب الجسم المضاد هذا باستخدام جسم مضاد ثان.

في حالة ELISA الشطيرة ، يكون التحليلي المستهدف عبارة عن مستضد ، يتم التقاطه على اللوحة باستخدام الجسم المضاد الملتقط ثم يتم اكتشافه بواسطة الجسم المضاد للكشف ، وبالتالي تكوين شطيرة جسم مضاد - مستضد - جسم مضاد. هذه الطريقة مفيدة لقياس تركيز مستضد في عينة مختلطة.

يتم استخدام ELISA التنافسي عندما يتوفر جسم مضاد واحد فقط لمولد الضد المستهدف. يتم طلاء اللوحة أولاً بالمستضد المنقى. وفي الوقت نفسه ، يتم تحضين العينة المحتوية على المستضد مسبقًا مع الجسم المضاد ثم إضافتها إلى اللوحة ، للسماح لأي جزيئات جسم مضاد حرة بالارتباط بالمستضد المعطّل. كلما زادت الإشارة من اللوحة ، انخفض تركيز المستضد في العينة. في جميع أنواع ELISA الأربعة ، المباشرة وغير المباشرة والساندويتش والتنافسية ، يكون الجسم المضاد للكشف إما مترافقًا بشكل مباشر مع الإنزيم أو يمكن ربطه بشكل غير مباشر من خلال جسم مضاد أو بروتين آخر.

الإنزيمات المستخدمة بشكل شائع للتفاعل هي بيروكسيداز الفجل أو الفوسفاتاز القلوي مع ركائزهما الخاصة ، وكلاهما ينتج منتجًا ملونًا قابلًا للذوبان يمكن قياسه وتحديد كميته باستخدام قارئ لوحة. في هذا الفيديو ، ستلاحظ كيفية إجراء ELISA غير المباشر ، و sandwich ELISA ، و ELISA التنافسي ، متبوعًا بأمثلة عن القياس الكمي للتحليل المستهدف من طرق ELISA غير المباشرة وطريقة الساندويتش.

ستوضح التجربة الأولى كيفية استخدام ELISA غير المباشر لتحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا في المصل المأخوذ من الفئران المصابة بالإنفلونزا.

للبدء ، أضف 50 ميكرولتر من المستضد المنقى - في هذه الحالة ، 2 ملليغرام لكل مليلتر من فيروس A / PR / 8 Influenza A المنقى - إلى كل بئر من صفيحة ELISA ذات 96 بئر. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوح بغطاء لاصق واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح للمستضد بالالتصاق باللوحة. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. بعد ذلك ، قم بحظر مواقع ربط البروتين المتبقية في الآبار المطلية عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر- هنا ، 5٪ من مصل الحمير في 1X PBS- لكل بئر. اترك الطبق ليحتضن لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر ثم اغسل اللوحة بإضافة 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1 ٪ توين -20. حرك اللوح فوق الحوض مرة أخرى لإزالة الغسل.

بعد ذلك ، قم بإعداد عينات الاختبار عن طريق إضافة 460 ميكرولتر من PBS إلى أنبوب جديد ، ثم إضافة 40 ميكرولتر من المصل لعمل تخفيف 1 إلى 12.5. ثم أضف 300 ميكرولتر من PBS إلى الأنبوب الثاني ، ثم أضف 100 ميكرولتر من التخفيف الأول. استمر في نطاق التخفيف التسلسلي هذا حتى الحصول على عينة نهائية بتخفيف من 1 إلى 204،800. أضف عينات المصل المخفف بشكل متسلسل في ثلاث نسخ إلى الآبار. غطي الصفيحة بغطاء لاصق واحتضنيها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد ذلك ، قم بإزالة العينات عن طريق تحريك اللوحة في الحوض ثم غسل اللوحة بإضافة 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1 ٪ توين -20. مرة أخرى ، حركي اللوح لإزالة الغسل.

الآن ، أضف 100 ميكرولتر من جسم مضاد ثانوي مترافق بالإنزيم ، والذي في هذه التجربة عبارة عن بيروكسيداز الفجل ، أو HRP ، مضاد للفأر مترافق ثانوي ، إلى كل بئر. احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ونفض الغبار لوحة لإزالة أي سائل فائض. اغسل اللوح باستخدام 1X PBS يحتوي على 1٪ توين -20 ثم ضع 100 ميكرولتر من ركيزة المؤشر بتركيز واحد مليغرام لكل مليلتر على كل بئر. احتضان اللوحة مع الركيزة لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في هذا المثال ، عديم اللون 3،3 & # 39 ، 5،5 & # 39 - رباعي ميثيل بنزيدين ، أو TMB ، تتحول الركيزة إلى اللون الأزرق عند وجود HRP. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 ميكرولتر من حامض الكبريتيك 2N. ستتحول العينات إلى اللون الأصفر.

في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف ، أدخل اللوحة في قارئ الصفيحة الدقيقة واقرأ اللوحة بطول الموجة المناسب للركيزة لتحديد امتصاص الآبار.

لبدء شطيرة ELISA ، يجب أن تكون اللوحة مغطاة بجسم مضاد للالتقاط المنقى. للقيام بذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الملتقط بتركيز في حدود 1-10 ميكروغرام لكل مليلتر ، إلى كل بئر من صفيحة ELISA ذات 96 بئر. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوح بغطاء لوح لاصق ثم احتضان اللوحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.

الآن ، قم بإغلاق مواقع الارتباط بالبروتين المتبقية في الآبار المغلفة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 5٪ حليب جاف خالي الدسم إلى الآبار. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر ، ثم اغسل الآبار باستخدام برنامج تلفزيوني 1X يحتوي على 1٪ توين -20. قم بإزالة الغسل عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. الآن ، أضف 100 ميكرولتر من عينة الاختبار إلى الآبار ، وأغلق اللوح بغطاء لاصق ، ثم احضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بإزالة العينات عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض ثم اغسل الآبار بـ 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1 ٪ توين -20. حرك اللوحة فوق الحوض لإزالة الغسل ثم أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف عن الإنزيم المترافق إلى الآبار.

ختم اللوح بغطاء لاصق. اترك الطبق ليحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بإزالة الجسم المضاد للكشف غير المنضم عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض وغسل الآبار بـ 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1٪ توين -20. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من ركيزة المؤشر بتركيز 1 ملليغرام لكل مليلتر ، واحتضان اللوحة لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الإنزيمي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 2N إلى الآبار ثم اقرأ اللوحة في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف في قارئ الصفيحة الدقيقة.

لإجراء اختبار ELISA تنافسي ، قم أولاً بتغطية آبار لوحة ELISA ذات 96 بئرًا بـ 100 ميكرولتر من مستضد منقى بتركيز 1-10 ميكروغرام لكل مليلتر. قم بتغطية اللوحة بغطاء لوحة لاصقة ثم احتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول المستضد غير المنضم من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.

بعد ذلك ، قم بإغلاق مواقع الارتباط بالبروتين المتبقية في الآبار المطلية عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المحلول المنظم لكل بئر- هنا ، 5٪ حليب جاف خالي الدسم في PBS. احتضان اللوحة لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. أثناء سد الآبار ، قم بإعداد خليط الجسم المضاد في أنبوب 1.5 مليلتر بإضافة 150 ميكرولتر من عينة المستضد إلى 150 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي لكل بئر في الفحص. احتضان هذا الخليط لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. الآن ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. بعد ذلك ، اغسل الآبار بـ 1X PBS تحتوي على Tween 20 ثم أضف 100 ميكرولتر من عينة المستضد - خليط الجسم المضاد الأولي.

اترك الطبق ليحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة خليط العينة عن طريق تحريك اللوحة فوق حوض ثم اغسل الآبار باستخدام برنامج تلفزيوني 1X يحتوي على 1٪ توين -20 لإزالة أي جسم مضاد غير منضم. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المترافق بالإنزيم إلى كل بئر واحتضان اللوحة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل اللوحة بـ 1X PBS تحتوي على 1٪ توين -20 ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. انتظر لمدة 5-10 دقائق. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الإنزيمي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من حامض الكبريتيك 2N ثم قم بقياس الامتصاص في قارئ صفيحة ميكروسكوبية خلال 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف.

لمقايسة ELISA شبه الكمي غير المباشرة ، تم تحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا A في العينات المخففة تسلسليًا من مصل الفئران المصابة بالإنفلونزا من خلال قراءة امتصاص كل بئر عند 405 نانومتر في قارئ لوحة. يتم تصدير هذه البيانات الأولية إلى ورقة انتشار لأغراض الحساب. في هذه التجربة ، تم تكرار عينات المصل المخفف تسلسليًا ، والتي تتراوح من 1 - 12.5 ، إلى 1 - 204.800 ، في ثلاث نسخ.

لتحليل البيانات ، يتم حساب متوسط ​​قيمة الامتصاص لكل مجموعة من النسخ الثلاث عن طريق إضافة جميع القيم لكل تخفيف وقسمة المجموع على 3. بمجرد تحديد المتوسط ​​لكل مجموعة من النسخ الثلاث ، يتم رسم متوسط ​​قراءات OD450 مقابل التخفيفات المتسلسلة. تنخفض قراءات OD مع تخفيف المصل ، مما يشير إلى وجود أجسام مضادة أقل في العينات المخففة. في الساندويتش الكمي ELISA ، تمت إضافة التخفيفات ذات المعيار المعروف ، في هذه الحالة إعادة تركيب TNFalpha البشرية ، إلى لوحة 96 بئر وقراءتها مع العينات غير المعروفة.

لإنشاء المنحنى القياسي ، تم حساب متوسط ​​قيمة الامتصاص لكل مجموعة من قراءات التركيزات المعروفة. بعد ذلك ، تم رسم متوسط ​​قيمة الامتصاص على المحور الصادي ، مقابل تركيزات البروتين المعروفة على المحور السيني. تتم إضافة أفضل منحنى ملائم عبر النقاط في الرسم البياني.

بمجرد إنشاء المنحنى القياسي ، يمكن تحديد كمية بروتين TNFalpha في عينة الاختبار عن طريق حساب متوسط ​​قيمة الامتصاص لعينة الاختبار أولاً. في هذا المثال ، أعطت عينات الاختبار قراءات OD450 لـ 0.636 و 0. 681. إضافة هذه القيم وقسمة المجموع على 2 يعطي متوسط ​​0.659. من المحور y على الرسم البياني للمنحنى القياسي ، قم بتمديد الخط الأفقي من قيمة الامتصاص هذه إلى المنحنى القياسي. عند نقطة التقاطع ، قم بتمديد خط عمودي إلى المحور السيني واقرأ التركيز المقابل الذي يتوافق ، في عينة الاختبار هذه ، مع تركيز TNFalpha البالغ 38.72 بيكوغرام لكل مليلتر.

الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

نتائج

في المثال التالي من ELISA غير المباشر ، تم تحديد وجود IgG الخاص بفيروس الأنفلونزا A (IAV) في مصل الفئران المصابة بـ IAV. أصيبت الفئران C57Bl / 6 بفيروس الأنفلونزا A (A / PR / 8 10 5 PFU في 100 & # 181L PBS i.p.) وتم جمع المصل بعد 28 يومًا. لتقدير كمية IgG الخاصة بـ IAV في المصل ، تم طلاء 96 لوحة ELISA المنقى بفيروس A / PR / 8 Influenza A (50 & # 181L / بئر 2 مجم / مل من فيروس PBS) طوال الليل عند 4 & # 176 درجة مئوية . تم حظر الألواح المطلية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع 5 ٪ من مصل الحمير الطبيعي في برنامج تلفزيوني ، تليها حضانة مع عينات مصل مخففة من الفئران التي تعاني من تحدي IAV طوال الليل عند 4 & # 176 درجة مئوية. تم تخفيف المصل مبدئيًا بنسبة 1: 12.5 ، متبوعًا بتخفيف 1: 4 (نطاق التخفيف - 1: 12.5 إلى 1: 204.800). بعد الغسل ، تم تحضين الأطباق باستخدام الفوسفاتيز القلوي (AP) - مترافق مع IgG مضاد للفأر على شكل حمار لمدة ساعة واحدة. تم غسل الأطباق ، ثم ص- تمت إضافة فوسفات النيتروفينيل (PNPP 1 مجم / مل ، 100 & # 181 لتر / بئر). يتحول حل PNPP عديم اللون إلى اللون الأصفر عند وجود AP. بعد 5-10 دقائق ، تم إيقاف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 & # 181 لتر / بئر 2N H2وبالتالي4. تمت قراءة اللوحة على قارئ صفيحة ميكروسكوبية عند 405 نانومتر. النتائج التي تم الحصول عليها موضحة في الجدول 1 والشكل 1.

عينة آبار التطوير التنظيمي405 يقصد
المصل 1:12.5 أ 1 2.163 2.194
ب 1 2.214
C1 2.204
مصل 1:50 أ 1 1.712 1.894
ب 1 2.345
C1 1.624
مصل 1: 200 أ 1 1.437 1.541
ب 1 1.73
C1 1.456
مصل 1: 800 أ 1 1.036 0.957
ب 1 0.912
C1 0.923
مصل 1:3200 أ 1 0.579 0.48
ب 1 0.431
C1 0.429
مصل 1: 12800 أ 1 0.296 0.281
ب 1 0.312
C1 0.236
مصل 1: 51200 أ 1 0.308 0.283
ب 1 0.299
C1 0.243
مصل 1: 204800 أ 1 0.315 0.303
ب 1 0.298
C1 0.297

الجدول 1: بيانات مقايسة ELISA غير المباشرة. تخفيف المصل (من 1: 12.5 إلى 1: 204،800) ، من الفئران المصابة بفيروس الأنفلونزا A (IAV) التي تحتوي على قيم IgG الخاصة بـ IAV ، والكثافة البصرية (OD) (405 نانومتر) ومتوسط ​​OD405 القيم.


الشكل 1: مخطط مبعثر مقايسة ELISA غير المباشر من متوسط ​​التطوير التنظيمي405 القيم (+ S.D) والتخفيف في المصل (من 1: 12.5 إلى 1: 204.800) ، لفيروس الأنفلونزا A (IAV) - IgG المحدد في مصل الفئران المصابة بـ IAV. OD405 يمكن أن ترتبط القيم عكسيا بتخفيف المصل.

في المثال التالي لشطيرة ELISA ، تمت إضافة تخفيف 1: 2.5 لمعايير TNF & # 945 البشرية المؤتلف (بدءًا من تركيز 75 بيكوغرام / مل) إلى الآبار المشار إليها في لوحة مسطحة القاع 96 بئر. أدت هذه المعايير إلى تغيير مماثل بمقدار 2.5 ضعف في قراءات الامتصاص.

عينة التركيز (pg / mL) آبار قيم قيمة متوسط رجوع حساب التركيز متوسط
المعيار 1 75 أ 1 1.187 1.169 76.376 75.01
أ 2 1.152 73.644
المعيار 2 30 ب 1 0.534 0.52 30.827 29.962
B2 0.506 29.098
المعيار 3 12 C1 0.23 0.217 12.838 12.105
C2 0.204 11.372
المعيار 4 4.8 D1 0.09 0.084 5.055 4.726
د 2 0.078 4.398
المعيار 5 1.92 ه 1 0.033 0.031 1.941 1.86
ه 2 0.03 1.778
المعيار 6 0.768 F1 0.009 0.011 0.626 0.764
F2 0.014 0.901
المعيار 7 0.307 ش 1 0.002 0.004 0.238 0.377
G2 0.007 0.516

الجدول 2: بيانات المنحنى القياسي لـ TNF & # 945 Sandwich ELISA. أ 1: 2.5 تخفيف لمعايير TNF البشري المؤتلف & # 945 (75 إلى 0.3 بيكوغرام / مل) ، قيم OD (450 نانومتر) ، يعني OD450 القيم وحسابات التركيز الخلفي ومتوسطاتها.


الشكل 2: المنحنى القياسي لـ TNF & # 945 ساندويتش ELISA. تم تحليل تخفيف 1: 2.5 لمعايير TNF & # 945 البشري المؤتلف (75 إلى 0.3 بيكوغرام / مل) باستخدام ساندويتش ELISA.450 يمكن أن ترتبط القيم ارتباطًا مباشرًا بتركيزات التخفيف القياسية. تم تحديد كمية بروتين TNF & # 945 في عينة الاختبار باستخدام المنحنى القياسي ، والذي يتوافق مع تركيز 38.72 بيكوغرام / مل.

بمجرد إنشاء المنحنى القياسي ، تم تحديد كمية بروتين TNF & # 945 في عينة الاختبار. في مثال شطيرة ELISA هذا ، أعطت عينات الاختبار OD450 قراءة 0.636 و 0.681 والتي تعطي متوسط ​​0.6585. عند رسم قراءة OD450 على الرسم البياني أعلاه ، فإن هذا يتوافق مع تركيز TNF & # 945 البالغ 38.72 بيكوغرام / مل.

الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

التطبيقات والملخص

كما هو موضح ، تندرج مجموعة من المقايسات المناعية (مع اختلاف طفيف في البروتوكولات) ضمن عائلة تقنية ELISA. يعتمد تحديد إصدار ELISA الذي يجب استخدامه على عدد من العوامل ، بما في ذلك ما هو المستضد الذي يتم اكتشافه ، والجسم المضاد أحادي النسيلة المتاح لمولد ضد معين ، والحساسية المرغوبة للمقايسة (5). بعض نقاط القوة والضعف في ELISAs المختلفة الموصوفة هنا هي:

إليسا نقاط القوة نقاط الضعف
غير مباشر 1) حساسية عالية بسبب حقيقة أن العديد من الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالإنزيم يمكن أن ترتبط بالجسم المضاد الأساسي 1) قد تحدث إشارة خلفية عالية لأن طلاء المستضد الذي يهم اللوحة ليس محددًا (أي أن جميع البروتينات في العينة ستغطي اللوحة)
2) يمكن التعرف على العديد من الأجسام المضادة الأولية المختلفة بواسطة جسم مضاد ثانوي واحد مترافق مع إنزيم ، مما يمنح المستخدم المرونة في استخدام نفس الجسم المضاد الثانوي المترافق مع الإنزيم في العديد من ELISA المختلفة (بغض النظر عن المستضد الذي يتم اكتشافه)
3) أفضل خيار عندما يتوفر فقط جسم مضاد واحد لمولد الضد المعني
ساندويتش 1) يزيد استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بالتقاط واكتشاف المستضد من حساسية ونوعية المقايسة (مقارنةً بـ ELISA غير المباشر) 1) قد يكون تحسين تركيزات التقاط الأجسام المضادة وحيدة النسيلة واكتشافها أمرًا صعبًا (خاصة بالنسبة للمجموعات غير التجارية)
2) أفضل خيار للكشف عن بروتين كبير بحلقات متعددة (مثل السيتوكين)
تنافسي 1) يمكن استخدام عينات غير نقية 1) يتطلب كمية كبيرة من مستضد عالي النقاء لاستخدامه في طلاء الصفيحة
2) حساسية أقل لتأثيرات تخفيف الكاشف
3) مثالي للكشف عن الجزيئات الصغيرة (مثل الناشئ)

الجدول 3: ملخص. ملخص لنقاط القوة والضعف في تقنيات ELISA المختلفة.

في حين أن تقنية ELISA بسيطة ومفيدة ، إلا أن هناك بعض العيوب في أي ELISA. أحدهما هو عدم التيقن من كمية البروتين محل الاهتمام في عينات الاختبار. إذا كانت الكمية عالية جدًا أو منخفضة جدًا ، فقد تقع قيم الامتصاص التي حصل عليها قارئ الصفيحة الدقيقة أعلى أو أقل من حدود المنحنى القياسي ، على التوالي. هذا سيجعل من الصعب تحديد كمية البروتين الموجودة في عينات الاختبار بدقة. إذا كانت القيم عالية جدًا ، يمكن تخفيف عينة الاختبار قبل إضافتها إلى آبار اللوحة. ثم يلزم تعديل القيم النهائية وفقًا لمعامل التخفيف. كما ذكرنا ، تتطلب الأطقم محلية الصنع غالبًا تحسينًا دقيقًا لتركيزات الجسم المضاد المستخدمة لإنتاج نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية.

الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

مراجع

  1. بورستمان ، ت. وكيسيج إس تي. تقنيات المقايسة المناعية الإنزيمية. نظرة عامة. مجلة الطرق المناعية.150 (1-2), 5-21 (1992).
  2. سليمان أيدين. تاريخ قصير ومبادئ وأنواع ELISA وخبرتنا المعملية مع تحليلات الببتيد / البروتين باستخدام ELISA. الببتيدات, 72, 4-15 (2015).
  3. غان. S.D and Patel K. R. Enzyme Immunoassay and Enzyme-linked Immunosorbent Assay. مجلة الأمراض الجلدية الاستقصائية, 133 (9), 1-3 (2013).
  4. Kohl و T. O. و Ascoli C.A. مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم المناعي للأجسام المضادة. بروتوكولات كولد سبرينج هاربور, 1 (6), (2017).
  5. ساكاموتو ، إس ، بوتالون ، دبليو ، فيمولمانكانج ، إس ، فولشاروين ، دبليو ، شوياما ، واي ، تاناكا ، إتش ، وموريموتو إس. مجلة الأدوية الطبيعية, 72 (1), 32-42 (2018).

كشف الدرجات

الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم ، أو ELISA هو اختبار كمي شديد الحساسية يستخدم عادة لقياس تركيز مادة تحليلية مثل السيتوكينات والأجسام المضادة في عينة بيولوجية. يتضمن المبدأ العام لهذا الاختبار ثلاث خطوات: البدء بالتقاط ، أو تثبيت ، المادة التحليلية المستهدفة على لوحة ميكروية ، متبوعة باكتشاف التحليل بواسطة بروتينات الكشف الخاصة بالهدف ، وأخيرًا ، تفاعل الإنزيم ، حيث يكون الإنزيم المترافق يحول ركائزه إلى منتج ملون. استنادًا إلى طرق مختلفة للالتقاط والكشف ، يمكن أن تكون ELISA من أربعة أنواع: مباشرة ، وغير مباشرة ، وشطيرة ، وتنافسية.

بالنسبة إلى ELISA المباشر ، يتم ربط المستضد المستهدف أولاً باللوحة ، ثم يتم اكتشافه بواسطة جسم مضاد محدد للكشف. تستخدم هذه الطريقة بشكل شائع لفحص الأجسام المضادة لمستضد معين. يتم استخدام ELISA غير المباشر للكشف عن الأجسام المضادة في عينة من أجل تحديد الاستجابات المناعية. يتم طلاء اللوحة أولاً بمولد ضد التقاط محدد ، والذي يعمل على شل حركة الجسم المضاد المستهدف ، ثم يتم اكتشاف مركب الجسم المضاد هذا باستخدام جسم مضاد ثان.

في حالة ELISA الشطيرة ، يكون التحليلي المستهدف عبارة عن مستضد ، يتم التقاطه على اللوحة باستخدام الجسم المضاد الملتقط ثم يتم اكتشافه بواسطة الجسم المضاد للكشف ، وبالتالي تكوين شطيرة جسم مضاد - مستضد - جسم مضاد. هذه الطريقة مفيدة لقياس تركيز مستضد في عينة مختلطة.

يتم استخدام ELISA التنافسي عندما يتوفر جسم مضاد واحد فقط لمولد الضد المستهدف. يتم طلاء اللوحة أولاً بالمستضد المنقى. وفي الوقت نفسه ، يتم تحضين العينة المحتوية على المستضد مسبقًا مع الجسم المضاد ثم إضافتها إلى اللوحة ، للسماح لأي جزيئات جسم مضاد حرة بالارتباط بالمستضد المعطّل. كلما زادت الإشارة من اللوحة ، انخفض تركيز المستضد في العينة. في جميع أنواع ELISA الأربعة ، المباشرة وغير المباشرة والساندويتش والتنافسية ، يكون الجسم المضاد للكشف إما مترافقًا بشكل مباشر مع الإنزيم أو يمكن ربطه بشكل غير مباشر من خلال جسم مضاد أو بروتين آخر.

الإنزيمات المستخدمة بشكل شائع للتفاعل هي بيروكسيداز الفجل أو الفوسفاتيز القلوي مع ركائزهما الخاصة ، وكلاهما ينتج منتجًا ملونًا قابلًا للذوبان يمكن قياسه وتحديد كميته باستخدام قارئ لوحة. في هذا الفيديو ، ستلاحظ كيفية إجراء ELISA غير المباشر ، و sandwich ELISA ، و ELISA التنافسي ، متبوعًا بأمثلة عن القياس الكمي للتحليل المستهدف من طرق ELISA غير المباشرة وطريقة الساندويتش.

ستوضح التجربة الأولى كيفية استخدام ELISA غير المباشر لتحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا في المصل المأخوذ من الفئران المصابة بالإنفلونزا.

للبدء ، أضف 50 ميكرولتر من المستضد المنقى - في هذه الحالة ، 2 ملليغرام لكل مليلتر من فيروس A / PR / 8 Influenza A المنقى - إلى كل بئر من صفيحة ELISA ذات 96 بئر. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوح بغطاء لاصق واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح للمستضد بالالتصاق باللوحة. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. بعد ذلك ، قم بحظر مواقع الارتباط بالبروتين المتبقية في الآبار المطلية عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر- هنا ، 5٪ من مصل الحمير في 1X PBS- لكل بئر. اترك الطبق ليحتضن لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة.بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر ثم اغسل اللوحة بإضافة 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1 ٪ توين -20. حرك اللوح فوق الحوض مرة أخرى لإزالة الغسل.

بعد ذلك ، قم بإعداد عينات الاختبار عن طريق إضافة 460 ميكرولتر من PBS إلى أنبوب جديد ، ثم إضافة 40 ميكرولتر من المصل لعمل تخفيف 1 إلى 12.5. ثم أضف 300 ميكرولتر من PBS إلى الأنبوب الثاني ، ثم أضف 100 ميكرولتر من التخفيف الأول. استمر في نطاق التخفيف التسلسلي هذا حتى الحصول على عينة نهائية بتخفيف من 1 إلى 204،800. أضف عينات المصل المخفف بشكل متسلسل في ثلاث نسخ إلى الآبار. غطي الصفيحة بغطاء لاصق واحتضنيها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد ذلك ، قم بإزالة العينات عن طريق تحريك اللوحة في الحوض ثم غسل اللوحة بإضافة 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1 ٪ توين -20. مرة أخرى ، حركي اللوح لإزالة الغسل.

الآن ، أضف 100 ميكرولتر من جسم مضاد ثانوي مترافق بالإنزيم ، والذي في هذه التجربة عبارة عن بيروكسيداز الفجل ، أو HRP ، مضاد للفأر مترافق ثانوي ، إلى كل بئر. احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ونفض الغبار لوحة لإزالة أي سائل فائض. اغسل اللوح باستخدام 1X PBS يحتوي على 1٪ توين -20 ثم ضع 100 ميكرولتر من ركيزة المؤشر بتركيز واحد مليغرام لكل مليلتر على كل بئر. احتضان اللوحة مع الركيزة لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في هذا المثال ، يتحول لون الركيزة عديم اللون 3،3 '، 5،5' - tetramethylbenzidine ، أو TMB ، إلى اللون الأزرق عند وجود HRP. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الأنزيمي بإضافة 100 ميكرولتر من حامض الكبريتيك 2N. ستتحول العينات إلى اللون الأصفر.

في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف ، أدخل اللوحة في قارئ الصفيحة الدقيقة واقرأ اللوحة بطول الموجة المناسب للركيزة لتحديد امتصاص الآبار.

لبدء شطيرة ELISA ، يجب أن تكون اللوحة مغطاة بجسم مضاد للالتقاط المنقى. للقيام بذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الملتقط بتركيز في حدود 1-10 ميكروغرام لكل مليلتر ، إلى كل بئر من صفيحة ELISA ذات 96 بئر. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوح بغطاء لوح لاصق ثم احتضان اللوحة طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الطلاء عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.

الآن ، قم بإغلاق مواقع الارتباط بالبروتين المتبقية في الآبار المغلفة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 5٪ حليب جاف خالي الدسم إلى الآبار. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر ، ثم اغسل الآبار باستخدام برنامج تلفزيوني 1X يحتوي على 1٪ توين -20. قم بإزالة الغسل عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. الآن ، أضف 100 ميكرولتر من عينة الاختبار إلى الآبار ، وأغلق اللوح بغطاء لاصق ، ثم احضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بإزالة العينات عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض ثم اغسل الآبار بـ 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1 ٪ توين -20. حرك اللوحة فوق الحوض لإزالة الغسل ثم أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف عن الإنزيم المترافق إلى الآبار.

ختم اللوح بغطاء لاصق. اترك الطبق ليحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، قم بإزالة الجسم المضاد للكشف غير المنضم عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض وغسل الآبار بـ 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1٪ توين -20. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من ركيزة المؤشر بتركيز 1 ملليغرام لكل مليلتر ، واحتضان اللوحة لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الإنزيمي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 2N إلى الآبار ثم اقرأ اللوحة في غضون 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف في قارئ الصفيحة الدقيقة.

لإجراء اختبار ELISA تنافسي ، قم أولاً بتغطية آبار لوحة ELISA ذات 96 بئرًا بـ 100 ميكرولتر من مستضد منقى بتركيز 1-10 ميكروغرام لكل مليلتر. قم بتغطية اللوحة بغطاء لوحة لاصقة ثم احتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول المستضد غير المنضم من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض.

بعد ذلك ، قم بإغلاق مواقع الارتباط بالبروتين المتبقية في الآبار المطلية عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المحلول المنظم لكل بئر- هنا ، 5٪ حليب جاف خالي الدسم في PBS. احتضان اللوحة لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. أثناء سد الآبار ، قم بإعداد خليط الجسم المضاد في أنبوب 1.5 مليلتر بإضافة 150 ميكرولتر من عينة المستضد إلى 150 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي لكل بئر في الفحص. احتضان هذا الخليط لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. الآن ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر من الآبار عن طريق تحريك اللوحة فوق الحوض. بعد ذلك ، اغسل الآبار بـ 1X PBS تحتوي على Tween 20 ثم أضف 100 ميكرولتر من عينة المستضد - خليط الجسم المضاد الأولي.

اترك الطبق ليحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة خليط العينة عن طريق تحريك اللوحة فوق حوض ثم اغسل الآبار باستخدام برنامج تلفزيوني 1X يحتوي على 1٪ توين -20 لإزالة أي جسم مضاد غير منضم. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المترافق بالإنزيم إلى كل بئر واحتضان اللوحة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، اغسل اللوحة بـ 1X PBS تحتوي على 1٪ توين -20 ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر. انتظر لمدة 5-10 دقائق. بعد 10 دقائق ، أوقف التفاعل الإنزيمي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من حامض الكبريتيك 2N ثم قم بقياس الامتصاص في قارئ صفيحة ميكروسكوبية خلال 30 دقيقة من إضافة محلول الإيقاف.

لمقايسة ELISA شبه الكمي غير المباشرة ، تم تحديد وجود الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا A في العينات المخففة تسلسليًا من مصل الفئران المصابة بالإنفلونزا من خلال قراءة امتصاص كل بئر عند 405 نانومتر في قارئ لوحة. يتم تصدير هذه البيانات الأولية إلى ورقة انتشار لأغراض الحساب. في هذه التجربة ، تم تكرار عينات المصل المخفف تسلسليًا ، والتي تتراوح من 1 - 12.5 ، إلى 1 - 204.800 ، في ثلاث نسخ.

لتحليل البيانات ، يتم حساب متوسط ​​قيمة الامتصاص لكل مجموعة من النسخ الثلاث عن طريق إضافة جميع القيم لكل تخفيف وقسمة المجموع على 3. بمجرد تحديد المتوسط ​​لكل مجموعة من النسخ الثلاث ، يتم رسم متوسط ​​قراءات OD450 مقابل التخفيفات المتسلسلة. تنخفض قراءات OD مع تخفيف المصل ، مما يشير إلى وجود أجسام مضادة أقل في العينات المخففة. في الساندويتش الكمي ELISA ، تمت إضافة التخفيفات ذات المعيار المعروف ، في هذه الحالة إعادة تركيب TNFalpha البشرية ، إلى لوحة 96 بئر وقراءتها مع العينات غير المعروفة.

لإنشاء المنحنى القياسي ، تم حساب متوسط ​​قيمة الامتصاص لكل مجموعة من قراءات التركيزات المعروفة. بعد ذلك ، تم رسم متوسط ​​قيمة الامتصاص على المحور الصادي ، مقابل تركيزات البروتين المعروفة على المحور السيني. تتم إضافة أفضل منحنى ملائم عبر النقاط في الرسم البياني.

بمجرد إنشاء المنحنى القياسي ، يمكن تحديد كمية بروتين TNFalpha في عينة الاختبار عن طريق حساب متوسط ​​قيمة الامتصاص لعينة الاختبار أولاً. في هذا المثال ، أعطت عينات الاختبار قراءات OD450 لـ 0.636 و 0. 681. إضافة هذه القيم وقسمة المجموع على 2 يعطي متوسط ​​0.659. من المحور y على الرسم البياني للمنحنى القياسي ، قم بتمديد الخط الأفقي من قيمة الامتصاص هذه إلى المنحنى القياسي. عند نقطة التقاطع ، قم بتمديد خط عمودي إلى المحور السيني واقرأ التركيز المقابل الذي يتوافق ، في عينة الاختبار هذه ، مع تركيز TNFalpha البالغ 38.72 بيكوغرام لكل مليلتر.


مقدمة

داء المتورقات (= داء المتورقات) هو مرض حيواني المنشأ ناشئ في جميع أنحاء العالم ينتج عن الإصابة بالديدان المثقوبة من الجنس متورقة. النوعان الرئيسيان لهذا الجنس ، F. الكبد و F. عملاق، مسببة للأمراض للإنسان والماشية [1]. بالنظر إلى التوزيع العالمي ، F. عملاق هو النوع الوحيد الموجود في غرب إفريقيا ، بينما F. الكبد هو النوع الوحيد الموجود في أوروبا والأمريكتين وأستراليا والمغرب الأفريقي [2]. ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن كلا النوعين يتعايشان في شرق وجنوب أفريقيا وكذلك في العديد من مناطق آسيا [3]. إن وجود نوعين مع مناطق متداخلة له آثار على تطوير اختبارات تشخيصية حساسة للتطبيق العام.

عادة ، تشخيص العدوى البشرية والحيوانية التي يسببها متورقة يتم إجراء الأنواع عن طريق التنظير الكروي أو تقنيات المناعة ، بما في ذلك تحديد المستضدات المنتشرة في مصل الدم ، وقياس المستضدات المشتركة واكتشاف الأجسام المضادة في الدم [4 ، 5]. على الرغم من أن تقنيات علم الأمراض مفيدة من حيث رخص المواد المختبرية واكتشاف العدوى النشطة ، إلا أنها تستغرق وقتًا طويلاً وتتطلب موظفين خبراء ولديهم حساسية ضعيفة. تتميز الطرق المصلية بميزة السماح بالتشغيل الآلي السهل ، وهو أمر ذو أهمية كبيرة للتعامل مع كميات كبيرة من العينات. هذه الطرق حساسة للغاية ويمكن استخدامها للرصد المبكر متورقة العدوى في القطعان باستخدام عينات من المصل أو الحليب [6]. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات لا تفرق بين الأجسام المضادة التي تسببها العدوى / العداوى الحالية وتلك التي لا تزال موجودة في الحيوانات أو البشر الذين تم علاجهم بنجاح باستخدام مضادات الديدان خلال الماضي. متورقة عدوى. طرق كشف التدوير متورقة المستضدات و / أو المستضدات المشتركة تحل المشاكل المذكورة أعلاه المرتبطة بالتقنيات المصلية والمصلية. ومع ذلك ، يُفضل الكشف عن المستضدات المشتركة لأن أخذ العينات ليس باضعًا ولا يقتصر وجود المستضدات في البراز على الوقت ، كما قد يحدث مع المستضدات المنتشرة. علاوة على ذلك ، فإن هذه الأساليب منتشرة على نطاق واسع ، حيث يمكن استخدام نفس الأساليب للكشف متورقة المستضدات المشتركة في عينات البراز من البشر وأنواع الحيوانات.

في العقود الماضية ، تم الإبلاغ عن العديد من طرق الالتقاط ELISA التي تستخدم الأجسام المضادة أحادية النسيلة و / أو متعددة النسيلة لتكون قادرة على اكتشاف كميات صغيرة من متورقة المستضدات المشتركة في عينات البراز [7-10]. ومع ذلك ، منذ ذلك الحين ، تم استخدام مجموعة BIO K 201 فقط (BIO X Diagnostics ، بلجيكا) ، أي الإصدار التجاري من MM3-COPRO ELISA [9] ، عالميًا. منذ أن تم تسويقه (في عام 2007) ، تم التعرف على كلا الإصدارين من الاختبار كأدوات تشخيصية قيمة للكشف متورقة العدوى أو لرصد فعالية العلاج بالديدان في العديد من الدراسات [9-16]. ومع ذلك ، خلال سنوات من استخدام اختبارات MM3-ELISA ، تم أيضًا تسليط الضوء على عيبين: 1) صعوبة الاختبار التجاري [17-20] ، الذي يستخدم أفيدين - الفجل الحار بيروكسيديز (HRP) كمقارن ثانوي ، في الحفاظ على حساسية اختبار MM3-COPRO الداخلي الأصلي ، و 2) اعتماد اختبار MM3-COPRO الداخلي على دفعات معينة من الأجسام المضادة IgG المضادة للفأر التي تحمل علامة HRP ، للحصول على حساسية وخصوصية جيدة. لمنع هذه العيوب ولضمان منتج متجانس وحساس للغاية ، قمنا بالتحقيق في إمكانية استبدال الكواشف الثانوية المذكورة أعلاه بنظام اكتشاف HRP (PolyHRP) المبلمر بالستربتافيدين (SA) وقمنا بتقييم شروط استخدام هذا الكاشف. وجدنا أن نظام تحسين ELISA هذا هو تحسين على الكواشف الثانوية الكلاسيكية لأنه يزيد من حساسية اختبارات ELISA المذكورة أعلاه مع تمكين تقليل وقت الحضانة المطلوب.


1 المقدمة

أثرت جائحة فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) الناتجة عن متلازمة الالتهاب التنفسي الحادة الوخيمة على حضارتنا بشدة - متجاوزة الدول ، مما أدى إلى خسائر فادحة في الاقتصاد العالمي ، وأرواح ثمينة. يعد الاكتشاف المبكر للعدوى عن طريق الفحص الجماعي للمجتمعات أمرًا بالغ الأهمية في الحد من انتشار الفيروس حيث تشير الأدلة المتزايدة إلى انتشار العدوى عن طريق الأفراد الذين لا تظهر عليهم أعراض انتشار العدوى من قبل الأفراد الذين لا تظهر عليهم أعراض (Hogan et al. ، 2021 Yu et al. ، 2020). (هوجان وآخرون ، 2021). هذه المعلومات محورية أيضًا لتحديد سياسات الصحة العامة الفعالة (Hinchman et al.، 2020). يتم تطوير عدة طرق للكشف عن عدوى SARS-CoV-2. تعتمد هذه الطرق على أي من اكتشاف الأحماض النووية الفيروسية باستخدام RT-PCR و LAMP و SHERLOCK (Broughton et al.، 2020 Esbin et al.، 2020 Park et al.، 2020 Shen et al.، 2020) والمستضد الفيروسي (Mak et al.، 2020). al. ، 2020 Porte et al. ، 2020) أو الاستجابة المناعية للمضيف للعدوى (ELISA ، اختبارات التشخيص السريع القائمة على الأجسام المضادة) (Kontou et al. ، 2020 Petherick ، ​​2020). كل من هذه الاختبارات لها فائدتها الخاصة ونافذة الاستخدام. على سبيل المثال ، تعد الاختبارات المعتمدة على الحمض النووي والمستضد مفيدة للكشف عن العدوى النشطة بينما يمكن للاختبارات المعتمدة على الأجسام المضادة تحديد التعرض للفيروسات وقد تشير إلى وجود أجسام مضادة واقية (Manners et al.، 2020).

الفجل - بيروكسيديز - يحاكي DNAzyme (HRPzyme) هو تسلسل قصير للحمض النووي يتألف من تسلسل غني بجوانين (G) ، والذي يطوي في بنية G-quadruplex التي تستقر عند تكوين مركب مع الهيمين (Travascio et al. ، 1998). HRPzyme قادر على تحفيز بيروكسيد مختلف ركائز HRP مثل 3،3 & # x02032،5،5 & # x02032-Tetramethylbenzidine (TMB) و 2،2 & # x02032-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ( ABTS) بحضور H.2ا2 يعطي قراءات لونية. يسمح التسلسل القصير لـ HRPZyme بإمكانية تكامل التمهيدي بطريقة لا يتشكل فيها تسلسل HRPZyme الوظيفي إلا عند التضخيم الناجح للمنطقة الجينومية المستهدفة. تم تطوير العديد من الاختبارات القائمة على HRPZyme و G-quadruplex (Xi et al. ، 2020) مسبقًا للكشف عن مسببات الأمراض مثل المكورات العنقودية الذهبية (موندال وآخرون ، 2018) ، السالمونيلا المعوية Typhimurium (Kim et al.، 2018)، norovirus (Batule et al.، 2018) وحتى فيروس كورونا (Anantharaj et al.، 2020) إلا أن حساسيتها المنخفضة أعاقت التطبيقات البشرية. نُبلغ هنا عن استخدام تسلسل HRPZyme معدل (Li et al. ، 2016) مع حساسية محسّنة للكشف عن عدوى SARS-CoV-2 في العينات البشرية. يوفر التعرف بمساعدة HRPZyme للعدوى عن طريق القياس البصري (HARIOM) مزايا مزدوجة - خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والحساسية المعززة للتفاعل المحفز بالإنزيم. تشمل الميزات البارزة الأخرى للنظام متانته ، ومتطلبات الحد الأدنى من المعرفة التقنية واستخدام الكواشف غير المكلفة ، مما يجعله مثاليًا للاستخدام في الأماكن منخفضة الموارد والفحوصات الجماعية.

نظرًا لأن HARIOM يستخدم قوة النشاط الأنزيمي المدمج ، فإنه يوفر إمكانية التأثير الإضافي من التضخيم المتزامن للنصوص المتعددة في نفس العينة ، وبالتالي تعزيز الحساسية بشكل أكبر. نظهر نفس الشيء باستخدام الاشعال الذي يستهدف الجين ORF-1ab و N في تفاعل وعاء واحد. كان الاختبار قادرًا على اكتشاف 10 نسخ 2 من الحمض النووي الريبي الفيروسي كما هو محدد عن طريق نسخ متصاعدة من الحمض النووي الريبي الفيروسي في عينات اللعاب. علاوة على ذلك ، قمنا بالتحقق من صحة طريقتنا في عينات مرضى COVID-19 من مسحات البلعوم الأنفي أو مسحة الفم. وجدنا توافقًا مطابقًا مع نتائج RT-PCR و TrueNAT 2-gene ، وبالتالي نعتقد أن HARIOM يمكن أن يكون أداة قيمة للكشف عن عدوى SARS-CoV-2.


تجربة ELISA بسيطة تعتمد على أنبوب الاختبار لفصل المدرسة الثانوية *

يكتسب علم المناعة مكانة بارزة في كل من وسائل الإعلام وكذلك في اختبار تحديد المستوى المتقدم (AP) في علم الأحياء. تتمثل إحدى تحديات تدريس الموضوعات البيولوجية الحديثة مثل علم المناعة والكيمياء الحيوية في المدارس الثانوية في زيادة الاعتماد على التكنولوجيا باهظة الثمن في عالم البحث. للبدء في سد هذه الفجوة المتسعة ، ابتكرنا تجربة باستخدام مقايسة ماصة مناعية جديدة مرتبطة بالإنزيم على نطاق واسع ومناسبة لفصول البيولوجيا في المدارس الثانوية على مستوى AP وكذلك المختبرات الجامعية للمبتدئين. لا تتطلب هذه الطريقة الجديدة قارئًا لوحيًا لتحليل البيانات ، ولكنها تعتمد بدلاً من ذلك على معدات أكثر شيوعًا ورخيصة مثل جهاز الطرد المركزي لأنبوب الاختبار السريري ومقياس طيف أنبوب اختبار بسيط. تركز الخطة التجريبية على الطلاب الذين يقيسون تركيزات الجسم المضاد في & # x0201cunknown & # x0201d العينات وتشمل جمع وتحليل منحنى قياسي باستخدام الكواشف التي أعدها المدرب. سيتم تعريف الطلاب على عمل الإنزيم ، وتقنية المختبر الكمي ، والأجسام المضادة ، وجهاز المناعة ، مع الهدف العام هو استكشاف وإبراز الروابط المتأصلة في مجالات الكيمياء الحيوية وعلم المناعة.

اختبارات الامتصاص المناعي المرتبطة بالإنزيم (ELISA) هي تقنيات كيميائية حيوية مصممة للكشف الكمي عن كميات صغيرة من العديد من الجزيئات بما في ذلك البروتينات والهرمونات والأجسام المضادة التي طورها في الأصل بيرلمان وزميله في أوائل السبعينيات [1]. على الرغم من وجود بعض الاختلافات في كيفية إجرائها (على سبيل المثال ، ELISA المباشر مقابل ELISA) ، تظل ELISA تقنية أساسية شائعة للغاية في كل من المختبرات السريرية [2 & # x020135] والمختبرات الاستقصائية [6 ، 7]. في العيادة ، وحتى في المنزل ، تعتبر ELISA أساسًا لمجموعة من التشخيصات الجزيئية. في المنزل ، تشمل هذه شرائط اختبار الحمل التي تكشف عن موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية وشرائط اختبارات الخصوبة التي تكشف عن الهرمون اللوتيني في البول. داخل العيادة ، ELISA مفيدة في الكشف عن مجموعة من المؤشرات الحيوية للمرض. هناك المئات من الأمثلة ، بما في ذلك مستضد البروستات النوعي (PSA) الموجود في مرضى سرطان البروستات [2 ، 3] ، والأجسام المضادة للنواة (ANA) في مرضى الذئبة [4] ، والبروتين السكري 120 (GP120) على سطح فيروس نقص المناعة البشرية في مرضى الإيدز [5]. على هذا النحو ، فإن طريقة ELISA منتشرة في كل مكان في حياة الجميع تقريبًا ، وبالتالي فهي بمثابة منصة متميزة للتمرين المخبري على مستوى المدرسة الثانوية.

في ELISA المباشر ، عادةً ما يتم تثبيت المستضد المستهدف في لوحة ميكروتيتر 96 بئرًا عبر تفاعل كيميائي ينتج عنه الارتباط التساهمي للمستضد ، وهو البروتين الأكثر شيوعًا ، من خلال مجموعات أمينية حرة. يتم إجراء الكشف بعد ذلك في ثلاث خطوات بسيطة ، والتي تشمل فحص البئر المطلي بجسم مضاد أولي خاص بمولد الضد المستهدف ، وسبر الجسم المضاد المرتبط باستخدام جسم مضاد ثانوي خاص بالمنطقة الثابتة من الجسم المضاد الأولي ، ثم الكشف باستخدام عدد من والخيارات. يترافق الجسم المضاد الثانوي بشكل نموذجي إما مع بيروكسيداز الفجل أو الفوسفاتيز القلوي. يمكن بعد ذلك اكتشاف هذه الإنزيمات بسهولة باستخدام تفاعل الركيزة اللونية ، وبالتالي تضخيم الإشارة وتزويد التقنية باسمها: مرتبط بالإنزيم. ثم يتم تحليل تغير اللون في قارئ لوحة مجهز لاكتشاف التغيرات في الامتصاص كمقياس لتركيز الجسم المضاد الهدف أو الأساسي.

يتم إجراء ELISA في لوحة لتسهيل تحليل أعداد كبيرة من العينات وتخفيفات الجسم المضاد الأولية. هناك حاجة إلى المعايير المعروفة ، عادةً في ثلاث نسخ ، في كل مرة يتم فيها إجراء الفحص لتوليد منحنى معياري للامتصاص الخطي مقابل تركيز المستضد أو الجسم المضاد والذي يستخدم بعد ذلك لحساب تركيزات العينات غير المعروفة بناءً على قيم الامتصاص الخاصة بها. لذلك فإن إكمال ELISA يعتمد على فهم أولي للبروتين و # x02013 ارتباط وخصوصية البروتين ، وعمل الإنزيم ، والكيمياء الأساسية ، ووظيفة الأجسام المضادة.

يمكن أن يكون أحد الاختلافات في ELISA عبارة عن مستضد مستهدف ثابت مغطى على الصفيحة ، ولكن بأجسام مضادة غير معروفة من عينات المريض. يُعد اختبار الأجسام المضادة للنواة (ANA) بمثابة مثال مناسب من حيث أن الغرض منه هو اكتشاف جسم مضاد معين في مجرى الدم للمريض بدلاً من هدف تلك الأجسام المضادة [8]. على هذا النحو ، يظل مستضد الصفيحة الثابت ثابتًا ، ويصبح العامل المجهول هو تركيز الجسم المضاد. هذا الترتيب هو أساس التمرين المخبري الحالي.

أكثر القيود شيوعًا للفصول الدراسية في المدارس الثانوية هي المعدات اللازمة لتنفيذ الأساليب التجريبية الحديثة. في حالة ELISA ، يلزم وجود قارئ لوحة ، والذي يكلف آلاف الدولارات وهو بعيد تمامًا عن متناول معظم ميزانيات المدارس الثانوية. وقد أدى ذلك إلى عمليات محاكاة قائمة على الويب مفيدة ولكنها أقل إرضاءً لتوضيح كيفية إجراء ELISA. في هذه المخطوطة ، وصفنا ELISA الجديد على نطاق واسع والذي يعتمد فقط على جهاز طرد مركزي لأنبوب اختبار سريري ومقياس طيف ضوئي أساسي بغرفة واحدة قادر على قراءة الامتصاصية عند 450 نانومتر. يتم تجميد مركب التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الثانية (MHCII) لجزيئات الراتينج كبديل للوحة الميكروترية النموذجية ELISA ، والتي تمكن جميع الحضانات اللاحقة وجمع البيانات من أن تتم في أنبوب اختبار زجاجي. تعمل التخفيفات المعيارية و # x0201cunknown & # x0201d للجسم المضاد أحادي النسيلة (mAb) المضاد لـ MHCII كعينة تجريبية ، وتم إنجاز الاكتشاف عن طريق بيروكسيداز الفجل القياسي (HRP) - جسم مضاد ثانوي مترافق. نقوم بالإبلاغ عن نتائج الفصل الدراسي في علم الأحياء في المدرسة الثانوية التنسيب المتقدم (AP) ، والذي يُظهر فعالية ومغفرة البروتوكول في أيدي الطلاب عديمي الخبرة. يدمج هذا التمرين المختبري بنجاح المهارات المختبرية الأساسية مثل الطرد المركزي ، وتقنية الماصة الدقيقة ، والقياس الطيفي مع إدخال المفاهيم الرئيسية في مجالات منهج بيولوجيا AP الحرجة مثل الكيمياء الحيوية للتفاعلات الجزيئية ، والأجسام المضادة ، وعمل الإنزيم في سياق الاستجابة المناعية.


شاهد الفيديو: Competitive ELISA Tutorial 1: How a Competitive ELISA Works (قد 2022).